摘要：目的为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法。方法本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-omp25与pET-omp31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,omp25与omp31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测。结果纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了omp25与omp31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测。结论研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测。

摘要：利用聚合酶链式反应(PCR),以羊布鲁菌16M基因组为模板克隆omp25基因,设计含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物序列,定向克隆到真核表达载体pCMV-HA上,构建真核表达重组质粒pCMV-HA-omp25。经测序及双酶切验证正确,证明成功构建了pCMV-HA-omp25真核表达质粒,为表达纯化外膜蛋白omp25,研究其功能奠定基础。

摘要：为了扩增呼和浩特地区布鲁菌omp25基因的序列,试验参照GenBank上已登录的布鲁菌外膜蛋白omp25的基因序列设计1对引物,采用聚合酶链式反应(PCR)技术从灭活的羊种布鲁菌中扩增出omp25基因片段,将其克隆到pMD19-T载体后测序并应用计算机软件进行分析。结果表明:所测定的序列与羊种布鲁菌(***)U33003 omp25基因的核苷酸同源性为99.5%,推导出的氨基酸同源性为98.1%;与绵羊种布鲁菌(***)U33004 omp25基因的核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为97.0%。

摘要：根据GeneBank库上国际标准菌株绵羊种布鲁氏菌(63/290)的omp25的基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)技术从新疆绵羊种布鲁氏菌(80/019)基因组DNA中扩增出omp25基因片段,T4DNA连接酶将其连接于PBS-T克隆载体质粒上,将重组质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,结果成功克隆omp25基因片段,进行核苷酸序列测定,测序结果分析表明:新疆绵羊菌株与国际标准菌株有明显差异。

摘要：目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白omp25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。