摘要：背景:p38mapk 是 mapk 信号转导途径的通道之一。但是,p38mapk 如何参与成骨细胞增殖、分化的调控,是否与成骨细胞的凋亡有关,目前尚未见相关文献报道。目的:观察 p38mapk 对新生大鼠成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,细胞学体外对比观察,于 2007-05/2008-03 在解放军兰州军区总院骨科研究所细胞培养室完成。材料:新生 24 h SD 大鼠 9 只用于分离成骨细胞;SB203580(p38mapk 的阻断剂)为 Sigma 公司产品。方法:取新生 SD 大鼠头盖骨成骨细胞。药物刺激组分别加入不同浓度(1×10-6,1×10-7,1×10-8 mol/L )的 17β-雌二醇、葛根素;含阻断剂组提前 30 min 添加 10 μmol/LSB203580 阻断信号转导通路,再加药物;设空白对照组。主要观察指标:作用 72 h 后用四甲基偶氮唑盐法与对硝基苯磷酸法测定细胞的增殖能力和碱性磷酸酶活性,Annexin V-FITC/pI 双标记流式细胞仪分析细胞早期凋亡。结果:加入 17β-雌二醇或葛根素药物后,成骨细胞的增殖、分化明显增强,与空白对照组比较差异有显著性意义(p 0.05);分化受到明显抑制,与未阻断组比较差异具有非常显著性意义(p 0.05)。结论:17β-雌二醇、葛根素能促进成骨细胞的增殖和分化并抑制其凋亡;p38mapk 在成骨细胞分化过程中发挥重要作用,对成骨细胞的增殖、凋亡无明显影响。

摘要：目的构建小鼠p38mapk基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38mapk表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38mapk mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,pCR筛选阳性克隆,测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38mapk-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量pCR检测MC3T3-E1细胞p38mapk mRNA表达,进行p38mapk干扰有效靶点的筛选。22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Westernblot检测MC3T3-E1细胞p38mapk蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡。结果酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38mapk-shRNA1、p38mapk-shRNA2、p38mapk-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108TU/ml。p38mapk-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-pCR检测结果显示,各p38mapk-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38mapk mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(p<0.01),其中以p38mapk-shRNA2的干扰效率最高。Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38mapk蛋白表达明显增加(p<0.01)。p38mapk-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38mapk蛋白表达水平较高糖组明显下调(p<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(p<0.01);p38mapk-shRNA慢病毒转染组以及p38mapk信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(p<0.05,p<0.01)。结论成功构建了靶向p38mapk基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38mapk基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。

摘要：目的探讨容量激活性氯离子通道(CLC3)在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞(pASMCs)中mRNA和蛋白表达的变化以及其与p38mapk信号通路的关系。方法取10只雄性SD大鼠,用酶消化法获得pASMCs并且进行原代培养,用小鼠抗大鼠SMα-actin免疫荧光细胞化学的方法进行鉴定。经培养鉴定的pASMCs随机分为:常氧组(N组,n=6),低氧组(H组,n=6),DMSO对照组(D组,n=6),SB203580干预组(SB组,n=6),Anisomycin干预组(A组,n=6),用免疫印迹技术检测CLC3蛋白的表达,半定量反转录-聚合酶链反应(RT-pCR)技术测定CLC3 mRNA水平的表达。结果与N组比较,H组pASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达量均显著上调(p均0.05)。结论低氧可上调大鼠pASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达;p38mapk通路抑制剂SB203580能上调pASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达;p38mapk通路激活剂Anisomycin可下调pASMCs中CLC3 mRNA和蛋白的表达。

摘要：目的构建沉默人p38mapk基因表达的RNA干扰的逆转录病毒表达载体。方法查找人p38mapk cDNA序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人p38mapk基因的短发夹状RNA的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体pSIREN上,获得重组质粒pSIREN-p38mapk,酶切和测序进行鉴定。结果双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。结论成功构建了沉默人p38mapk基因的重组质粒pSIREN-p38mapk。

摘要：目的观察褪黑素对LpS诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pASMCs)炎症的保护作用及作用机制。方法体外培养SD雄性大鼠pASMCs,随机分为5组:空白对照组(N组)、脂多糖(LpS)组、脂多糖+褪黑素(LpS+MLT)组(0.5mmol/L、1.0mmol/L)、LpS+p38mapk抑制剂(SB203580)(LpS+SB)组(5μmol/L)。CCK-8试验检测褪黑素对pASMCs的药物毒性;半定量RT-pCR分别检测mRNA水平丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,mapk)通路中p38mapk和核因子κB(nuclearactor-κB,NF-κB)的表达量;Western blot法检测p38mapk和NF-κB以及磷酸化p38mapk和NF-κB的表达量。结果在实验设计的浓度内,褪黑素对pASMCs无药物毒性不良反应(p>0.05)。与LpS组相比,LpS+MLT和LpS+SB抑制mapk信号通路中的磷酸化p38mapk和磷酸化NF-κB的表达(p<0.01),且随褪黑素的剂量的增加而降低(p<0.01)。结论褪黑素抑制mapk信号通路中p38mapk和NF-κB的激活,减轻LpS诱导的pASMCs炎性反应。

摘要：目的:检测骨形成发生蛋白9 (bone morphogenetic proteins 9,BMp9)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hpDLSCs)的成骨诱导分化能力,并探讨p38 mapk通路在该成骨分化中的作用。方法:培养h pDLSCs,腺病毒载体(Ad-BMp9)感染hpDLSCs后,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALp)活性测定与染色、定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qpCR)、钙盐沉积等方法,分别检测ALp、骨桥蛋白(osteopontin,OpN)、骨钙素(osteocalcin, OCN)的表达及钙盐沉积量,评价BMp9诱骨分化的能力。在Ad-BMp9感染hpDLSCs 36 h后,检测BMp9作用hpDLSCs后对p38及MKK3/6磷酸化(p-p38, p-MKK3/6)的影响,以及p38 mapk通路抑制剂SB203580预处理后BMp9-p38-mapk通路对hpDLSCs成骨分化的影响。采用SpSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:在Ad-BMp9作用下,ALp活性、OpN和OCN的表达均显著高于对照组(p<0.01), ALp染色与钙盐沉积结果与之吻合。Western印迹法检测发现,BMp9可增强p-p38、p-MKK3/6的表达。加入p38 mapk通路抑制剂后,ALp、及OpN、OCN的表达均显著降低(p<0.01),钙盐沉积、基质矿化也显著减弱。结论:在hpDLSCs的分化过程中,BMp9对其具有诱骨分化能力。MKK3/6-p38 mapk通路参与了该成骨分化过程且具有正向调节作用。

摘要：采用酶消化法取雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,pASMCs)进行原代培养,采用小鼠抗大鼠SMα-actin免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定;复制低氧高二氧化碳模型,采用免疫印迹法检测钙激活性氯离子通道(calcium activated chloride channel,CLCA2)蛋白的表达;采用半定量逆转录–聚合酶链反应(RT-pCR)技术测定CLCA2 mRNA水平的表达。结果显示:与正常组比较,低氧高二氧化碳组pASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(p<0.01);与低氧高二氧化碳组比较,U0126组和SB203580组pASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(p<0.01);茴香霉素(Anisomycin)组pASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白表达水平均显著下调(p<0.05和p<0.01)。研究表明,低氧高二氧化碳可上调大鼠pASMC中CLCA2 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2通路抑制剂(U0126)、p38mapk通路抑制剂(SB203580)均可上调pASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达;mapk通路激活剂(Anisomycin)能下调pASMCs中CLCA2 mRNA和蛋白的表达。

摘要：目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mapk)在促红细胞生成素(EpO)后处理减轻缺血/再灌注损伤大鼠肺细胞凋亡中的作用。方法雄性SD大鼠随机分成5组(n=8),即对照组(C组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、肺缺血/再灌注+促红细胞生成素组(促红细胞生成素组)、促红细胞生成素+溶剂对照组(D组)、促红细胞生成素+SB203580组(SB组)。分别于再灌注2h颈动脉取血、留取左肺组织,检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MpO),光镜观察肺组织形态学结构改变,并进行肺组织损伤定量评估(IQA);原位末端标记法(TUNEL)检测肺细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI)。结果与对照组相比,肺缺血/再灌注组血清超氧化物歧化酶活性显著降低,丙二醛含量、髓过氧化物酶活力显著升高(p0.05);SB203580组与促红细胞生成素组相比,丙二醛含量、髓过氧化物酶活力显著降低,超氧化物歧化酶活性升高(p<0.05或p<0.01),肺组织损伤定量评估和凋亡指数均显著降低(p<0.05或p<0.01),光镜下肺组织结构未见明显损伤。结论促红细胞生成素可以通过减轻肺组织过度氧化应激,肺内中性粒细胞聚集,抑制p38丝裂原活化蛋白激酶激活,改善I/R引起的肺组织结构破坏和肺细胞凋亡。

摘要：背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素。目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,试验于2008-03/10在山东省创伤骨科研究所完成。材料:p38mapk特异性阻断剂(SB203580)、JNK特异性阻断剂(Sp600125)购自碧云天生物技术有限公司;大鼠椎间盘来自2只新生24h SD大鼠。方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50,100,200,400,800μmol/L H2O2刺激;对照组:不加刺激的细胞;SB203580+H2O2组:给予特异性p38mapk阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激;Sp600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂Sp600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激。上述处理后检测相关指标。主要观察指标:以免疫组织化学检测p-p38和p-JNK的表达情况及表达位置;Western印迹法检测SApK/JNK、p38mapk及其磷酸化组分的表达。结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性;SB203580能够有效地抑制p38mapk的活性,而Sp600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示p-p38mapk和p-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现。结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38mapk和JNK通路导致细胞凋亡。

摘要：目的:探讨缺血后处理(IpO)是否通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mapk)活化来减轻再灌注损伤肺细胞的凋亡。方法:雄性SD大鼠40只,随机分成5组(n=8),即对照组(C组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、肺缺血/再灌注+缺血后处理组(IpO组)、缺血后处理+溶剂对照组(D组)、缺血后处理+SB203580组(SB组)。各组分别于再灌注2 h留取左肺组织,检测肺组织湿/干重比(W/D)和总肺含水量(TLW);光镜观察肺组织形态学结构改变并进行肺组织损伤定量评估(IQA);原位末端标记法(TUNEL)检测肺细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI);RT-pCR和免疫组化法测定Bax、Bcl-2基因和蛋白的表达。结果:与C组相比,I/R组W/D、TLW、IQA和AI均显著升高(p0.05);SB组与IpO组相比,肺组织W/D、TLW、IQA和AI均显著降低(p<0.05,p<0.01),肺组织结构未见明显损伤;Bcl-2、Bcl-2/Bax基因及蛋白表达明显升高,Bax基因及蛋白表达明显降低(p<0.05,p<0.01)。结论:I/R通过激活p38mapk导致大鼠肺泡结构严重破坏,肺内细胞大量凋亡;IpO可能是通过抑制p38mapk通路的激活而减轻I/R损伤。