摘要：【目的】探究盐适应条件下坎帕尼亚盐单胞菌(Halomonas campaniensis)的差异基因表达水平,挖掘四氢嘧啶(ectoine)合成代谢相关联的差异基因。【方法】设置无盐组NS (0 mol/L NaCl)、中盐组MS (1.5 mol/L NaCl)和高盐组HS (2.5 mol/L NaCl),培养H. campaniensis XH26菌株,利用IlluminaHiSeq测序进行转录组学分析,筛选四氢嘧啶合成代谢关联的差异基因,并进行qrt-pcr验证。【结果】菌株XH26胞内四氢嘧啶的积累量与盐度变化密切相关,1.5mol/LNaCl时积聚量最大为419.2mg/L。转录组测序(n=3/组)能定位到基因组测序序列的数量统计为87.24%–95.87%,共注释操纵子748个(涉及2 182个基因),转录起始-终止位点941个,预测新转录本456个,上调基因385个和下调基因326个(涉及245个KEGG通路)。组间NSvsMS分析表明,合成基因ectABC和lysC表达上调以促进四氢嘧啶生成,关联基因gltB、gltD、davT、hisD、alh-9、betA、acnB、pckA以及gadA表达上调,参与四氢嘧啶合成关联通路的上游调控。比较组MSvsHS分析表明,基因ectA、acnB、pckA、gadA和gdhA表达下调致使四氢嘧啶产量减少。qrt-pcr验证结果与组学测序的表达趋势相一致。【结论】四氢嘧啶生物合成与Asp(或天冬氨酸半缩醛)、上游氨基酸代谢网络(Asn、Glu、Gln和His)以及三羧酸循环(琥珀酸、延胡索酸和草酰乙酸)密切相关,此为后续四氢嘧啶合成途径的优化和代谢通路的整合设计提供重要的参考依据。

摘要：根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)时对病毒滴度检测的需要,本文针对IBDV VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-pcr(qrt-pcr)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×101～109拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-pcr检测方法的1 000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.5%。应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qrt-pcr方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。

摘要：[目的]详细介绍One Step SYBR Green I实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction,简称qrt-pcr)在定量检测靶基因mRNA转录水平上的应用。[方法]从样品准备、引物设计、核酸提取、反应体系构建、反应条件确定、标准曲线建立和目的基因定量等方面进行了分析。[结果]决定qrt-pcr反应成功与否的几个关键因素有模板的质量、底物的质量与浓度、引物的质量、酶和Mg2+、反应条件的优化。[结论]为畜牧兽医工作者利用分子生物学技术揭示疫病的发生机制和发病机理提供了技术参考,为基因表达的相对定量研究提供了方法支持。

摘要：为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型(BTV-29)的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2(Seg-2)的序列特征,分别设计用于RT-pcr与q RT-pcr方法的特异性引物与Taq Man探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1~BTV-24等核酸作为对照评价其特异性。对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,并用BTV群特异q RT-pcr方法验证其可靠性。结果显示,建立的BTV-29特异RT-pcr的灵敏度是1.12×10^(1)copies/μL,而BTV-29特异q RT-pcr的灵敏度是1.12×10^(2)copies/μL,均与BTV-1~BTV-24、流行性出血病病毒、帕利亚姆病毒和阿卡斑病毒之间无交叉反应;用BTV-29特异q RT-pcr检测BTV-29型感染山羊血液中的BTV-29核酸的动态变化,结果与BTV群特异q RT-pcr检测结果基本一致。本研究建立的BTV-29特异RT-pcr和q RT-pcr方法均具有良好的特异性和较高的灵敏度,能快速鉴别BTV-29,为BTV-29的致病性、诊断与流行病学研究提供了技术保障。

摘要：猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染引起猪以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,可造成极高的仔猪死亡率,且临床剖检很难与其他病毒性腹泻区别。本试验参考TGEV JS2012株N基因保守序列设计引物,构建阳性标准品,建立qrt-pcr检测方法。将阳性标准品10倍倍比稀释构建标准曲线,结果显示,在6.06×10^2~6.06×10^8拷贝/μL扩增具有良好的线性关系。同时对临床生产中常见的腹泻病毒:轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒核酸进行扩增,结果均为阴性,无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。通过与传统pcr检测方法对比,本试验建立的检测方法具有更高的灵敏性,为临床检测TGEV的早期感染和预防提供技术支持。

摘要：目的:建立一种基于qrt-pcr的微量细胞中和实验改良法,快速、定量检测汉滩病毒感染中的中和抗体活性。方法:将本室前期制备的抗汉滩病毒高中和活性鼠源性单抗3G1、鼠/人嵌合单抗1D9和感染剂量为100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1 h后感染Vero-E6细胞,提取细胞总RNA。根据GenBank数据库中汉滩病毒76-118株S基因序列设计特异性引物,在上述实验基础上以细胞总RNA为检测样品,建立qrt-pcr快速、定量检测汉滩病毒感染中中和抗体活性的实验方法。结果和结论:建立了一种基于qrt-pcr的微量细胞中和实验改良法,可定量测定汉滩病毒感染中的中和抗体活性,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。

摘要：建立一种阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的快速、准确、灵敏度高、特异性好的qrt-pcr核酸检测方法。通过对云南流行AKAV毒株的S片段序列进行分析,设计引物和探针,经优化建立AKAV qrt-pcr检测方法。优化后的最佳退火温度为60℃,选择制备病毒标准品的AKAV地方毒株(编号55)TCID 50效价为10^-4.25,通过梯度稀释建立的标准曲线线性关系较好。本方法灵敏度高、特异性好,对不同分离毒株和田间样本检测的结果显示,本方法不仅可以用于实验室鉴定,还可以用于田间样品的临床检测。成功建立了阿卡斑病毒qrt-pcr检测方法。

摘要：目的:通过分析白花鬼针草不同组织中候选糖基转移酶基因的表达规律,初步筛选可能参与聚多炔糖苷生物合成途径的糖基转移酶,为白花鬼针草的糖基转移酶基因的研究提供数据支持。方法:本研究利用白花鬼针草转录组数据库中的DN19630等19个候选糖基转移酶基因的DNA序列,设计特异性引物。通过qrt-pcr技术检测候选糖基转移酶基因在白花鬼针草叶、茎、果、花、根中相对表达量。结果:通过对DN19630等19个候选糖基转移酶基因pcr产物扩增情况、扩增曲线图、熔解曲线图及相对表达量进行综合分析,发现DN19630、DN18211、DN12914、DN6852、DN5000g2、DN38310、DN14409g1、DN5293、DN34556、DN14409g2、DN15831这11个候选糖基转移酶基因在叶中表达量相对较高,在根中表达量最低;而DN3608在茎中表达量最高,根中表达量较低;DN21732、DN14031在花中表达量较高,在根中表达量最低。结论:DN19630等14个糖基转移酶可能参与聚多炔糖苷类化合物的生物合成。Objective: By analyzing the expression patterns of candidate glycosyltransferase genes in different tissues of Bidens pilosa var. radiata, we initially screened the glycosyltransferases that may be involved in the biosynthetic pathway of polyacetylene glycosides, providing data support for the study of glycosyltransferase genes in B. pilosa var. radiata. Methods: This study used the DNA sequences of 19 candidate glycosyltransferase genes such as DN19630 from the transcriptome database of B. pilosa var. radiata to design specific primers. The relative expression levels of the selected glycosyltransferase genes in the leaves, stems, fruits, flowers, and roots of B. pilosa var. radiata were determined through qrt-pcr technology. Results: Through comprehensive analysis of the pcr product amplification status, amplification curves, melting curves, and relative expression levels of 19 candidate glycosyltransferase genes including DN19630, it was found that the expression levels of 11 candidate glycosyltransferase genes, namely DN19630, DN18211, DN12914, DN6852, DN5000g2, DN38310, DN14409g1, DN5293, DN34556, DN14409g2, and DN15831, were relatively high in leaves and lowest in roots. In contrast, DN3608 exhibited the highest expression level in stems and a lower expression level in roots. Additionally, DN21732 and DN14031 showed higher expression levels in flowers and the lowest expression levels in roots. Conclusion: A total of 14 glycosyltransferases, including DN19630, are potentially involved in the biosynthesis of p

摘要：浓缩丹宁(CT)和纯玉米型酒精糟能降低反刍动物肠道CH4的产量及其抗微生物及高脂成分。但浓缩丹宁和纯玉米型酒精对瘤胃内产甲烷菌的多样性的影响还未检测。试验旨在利用pcr梯度凝胶电泳(pcr-DGGE)和实时定量pcr(qrt-pcr)检测饲喂纯玉米型酒精糟(DDG)和从Acacia mearnsii提取的丹宁对瘤胃内产甲烷菌多样性的影响。试验用8头安装瘤胃瘘管的母牛,采用4×4拉丁方设计,共4期试验,每期35d。试验用处理日粮(DM):①对照组(Ctrl),0g DDG;②200g DDG;③400g DDG;④400g DDG+CT(25g)。在每期试验第25和28天的饲喂前从瘤胃4点采集食糜样。总DNA提取自瘤胃食糜中(如0.5mL液相+0.5g固相食糜混合)来获取16SrRNA基因扩增片段,pcr产物用于进行pcr-DGGE分析。pcr-DGGE检测的第1期和第2期的产甲烷菌形成一个簇,第3期和第4期的产甲烷菌形成另一个簇。通过对pcr-DGGE的所有25个条带进行鉴定,其中有16个条带成功克隆和测序。11个条带的测序结果表明,该微生物的基因与Methanobrevi-bacter sp.有97%～100%的相似性,序列的系统发育聚簇分析也证实了该结论。剩余条带同Methanosphaera stadma-nae进行聚簇分析。尽管日粮对总的产甲烷菌无影响,但增加DDG使条带4、5、6、7、9、11中的含量增加而条带16和18中的含量降低。所有处理日粮除400g DDG+CT外均有条带13和19,定量RT-pcr分析证实所有产甲烷菌基因的16SrRNA拷贝数在处理日粮间无差异。pcr-DGGE和RT-pcr结果说明包括DDG及DDG和CT混合物会改变瘤胃中产甲烷菌的多样性但不会改变瘤胃内产甲烷菌的16SrRNA总量,然而说明一些产甲烷的特定种属的拷贝数可以用于解释瘤胃产甲烷菌的多样性。

摘要：【目的】为筛选美国白蛾在不同温度处理、不同发育阶段、幼虫不同组织中稳定的内参基因,为美国白蛾相关的基因定量研究奠定基础。【方法】在美国白蛾转录组测序结果中筛选出8个候选内参基因GAPDH、ACT、RPL12、RPL18a、RPS16、EF1α、EF1β、18S rRNA,获得碱基序列。将以上序列进行克隆、测序、比对最终证明其为美国白蛾的基因且碱基序列正确,之后将其上传到NCBI获得登录号。设计以上8个候选内参基因的实时荧光定量pcr(qrt?pcr)引物,利用qrt?pcr技术测定8个候选内参基因在美国白蛾不同发育阶段(幼虫1~6龄)、不同温度处理下(-10、-5、0、25、35、40、45℃处理2 h)、幼虫的不同组织(头、肠道、脂肪体、马氏管、表皮)中的表达量,记录Ct值;然后通过ΔCt法、GeNorm、NormFinder和BestKeeper共4种方法对8个候选内参基因在不同条件下的Ct值进行统计分析,最后综合RelFinder选出最稳定的内参基因。通过GeNorm计算Vn/(n+1)最合适内参基因的数目。【结果】Ct分析表明,在不同发育阶段和在不同温度处理下表达最稳定的是RPL12;在幼虫不同组织中,最稳定的是RPS16。GeNorm分析结果与ΔCt分析结果相同。NormFinder分析表明,在不同的发育阶段和不同温度处理下最稳定的候选内参基因分别是RPL18a和EF1α;在幼虫组织中,最稳定的是ACT。BestKeeper分析认为,不同发育阶段,ACT、GAPDH不适合作为内参基因;不同温度处理下,ACT、RPL18a、RPL12、RPS16、EF1β不适合作为内参基因;在不同幼虫组织中,RPL18a、EF1α、EF1β、18S rRNA不适合作为内参基因。最后RelFinder综合评价显示,在不同的发育阶段最稳定的内参基因组合是RPL12和EF1β,最不稳定的是ACT;在不同的温度处理下,最稳定的内参基因组合是EF1α和GAPDH,最不稳定的是ACT;在不同组织中,最稳定的组合是ACT和RPS16,最不稳定的是RPL18a。经GeNorm软件计算,最合适的内参基因数目应该是2个。【结论】在美国白蛾不同发育阶段的基因定量研究中,建议以RPL12和EF1β作为内参基因;在不同温度处理的基因定量研究中,建议以EF1α和GAPDH作为内参基因;在幼虫不同组织的基因定量研究中,建议以ACT和RPS16作为内参基因。此外,亦初步说明了昆虫内参基因在不同试验条件下的不稳定性。