摘要：目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbe基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbef、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。

摘要：利用荧光定量PCR技术,建立快速、有效的检测乳中大肠杆菌O157:H7的方法。根据大肠杆菌O157:H7的rfb E基因序列设计一对特异性引物,以大肠杆菌O157:H7的DNA为模板进行PCR扩增,将目的基因进行克隆和测序,利用提取的重组质粒进行荧光定量PCR标准曲线的制备,建立荧光定量PCR的检测方法,并进行了灵敏性和特异性检测。结果显示:建立的荧光定量PCR方法特异性强,且灵敏度可达10-6ng/u L,利用建立的方法可检测到乳中67.0 m L-1的大肠杆菌O157:H7。该方法能够使乳中大肠杆菌的检测更为快速,并且更加准确和灵敏。

摘要：为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbe基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。

摘要：本试验针对肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7高度保守的rfbe基因序列设计合成引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测EHEC O157∶H7实时荧光定量PCR方法。结果显示,该法灵敏度约为7.3CFU/mL,对310份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出阳性样本20份,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。表明建立的实时荧光定量PCR方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。

摘要：目的建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RF-LAMP)快速检测大肠杆菌(Escherichia coli,EHEC)O157的分析斱法。方法针对大肠杆菌O157编码O抗原的rfbe基因设计引物。对该斱法迚行特异性验证,同时对大肠杆菌O157:H7纯培养物的灵敏度和人工污染牛肉的检出限迚行测定,对61份牛肉样品迚行RF-LAMP检测,幵与GB4789.36-2016斱法迚行比较,评价RF-LAMP斱法的敏感性、特异性和准确度。结果 10株大肠杆菌O157呈阳性结果, 21株非大肠杆菌O157呈阴性结果,该斱法特异性良好。纯培养物检测的灵敏度为5.1CFU/mL,人工污染的牛肉样品的检出限为5.1 CFU/g。结论本研究建立的RF-LAMP技术特异性好、灵敏度高、操作简单,可实时监测扩增反应,避克了繁琐的电泳过程,实现了对大肠杆菌O157的快速检测,对大肠杆菌O157引起的食源性疾病的预防和控制具有重要意义。

摘要：目的:大肠杆菌O157:H7是近年来引发食物中毒事件的重要病原菌,对其建立灵敏、特异的多重PCR检测方法,是确保饮食安全,预防和控制大肠杆菌O157:H7传播的重要手段。方法:根据大肠杆菌O157:H7rfbe和fliC抗原基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为678 bp(rfbe)和560 bp(fliC)。结果:建立的多重PCR方法可以快速特异地检测出猪肉、牛肉等动物性食品中的大肠杆菌O157:H7污染,人工污染猪肉检测限达到2.2×102cfu/ml。结论:选择两对特异引物的多重PCR方法可简便、快速、特异地实现对动物性食品中大肠杆菌O157:H7的检测。

摘要：[目的]为青海省部分地区市售的羊肉、牛肉进行了大肠杆菌O157:H7的检测。[方法]样品先用mEC肉汤增菌,然后在选择性培养基TC-SMAC培养,再根据GenBank上已发表的大肠杆菌O157:H7rfbe、fliC和eacA抗原基因的保守序列设计3对引物,进行多重PCR鉴定,将可疑菌接种于MUG-LST,进行微量生化试验鉴定。[结果]在各1株牛、羊肉分离菌中多重PCR同时扩增出了大小为678、560和368 bp的3条特异性条带,分离菌的生化反应特性符合大肠杆菌的特征。[结论]在羊、牛肉各1份样品中检出了*** O157:H7。

摘要：肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbe基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbe基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。