摘要：目的　研制一种新型的基因阵列 ,用于结核分枝杆菌耐利福平分离株rpob基因突变的快速检测。方法　根据结核分枝杆菌rpob基因序列设计寡核苷酸探针并制作基因阵列 ,用生物素标记的引物扩增结核分枝杆菌rpob基因突变热点的目的片断 ,与基因阵列杂交 ,同时以聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术及DNA测序法为对照。结果　 111株结核分枝杆菌临床分离株经PCR SSCP分析 ,4 1株RFP敏感株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同 ;70株耐RFP菌株中 ,6 3株(90 % )SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株不同 ,其余 7株SSCP图谱与结核分枝杆菌标准株相同。基因阵列检测结果 4 1株RFP敏感株杂交图谱与标准株完全相同 ,70株耐RFP临床分离株中 ,6 3株检测到rpob基因突变 ,检出率为 90 % ;其中 37株 (5 3% ) 5 31位丝氨酸 (Ser)置换 ,15株 (2 1% ) 5 2 6位组氨酸(His)置换 ,11株 (16 % )其他位置的氨基酸置换。基因阵列检测结果与PCR SSCP及测序结果一致。结论　用基因阵列法可简便、快速、准确地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpob基因突变。

摘要：目的应用滚环扩增(rolling circle amplification)技术建立对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法以结核分枝杆菌利福平耐药rpob基因为研究对象,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针。通过对突变型模板、野生型模板、非结核分枝杆菌基因序列模板及不同比例的突变型模板和野生型模板混合样本的检测,研究本实验方法的特异性和灵敏度。建立特异性地检测rpob基因单碱基突变的滚环扩增方法。通过对临床样本的检测并与测序结果比较,评价该方法的临床应用价值。结果通过优化反应条件,应用滚环扩增技术能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpob基因的单碱基突变。通过对含有不同比例突变型模板的混合样本检测,最低能检测出1%突变型/野生型模板的样本。80株临床样本的检测与测序结果一致。结论滚环扩增技术特异性高、灵敏度高,无需特殊昂贵仪器且简单易操作,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,是具有临床应用前景的方法。

摘要：目的　了解本地区结核分枝杆菌对利福平 (RFP)耐药基因的突变情况 ,探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法。方法　针对rpob基因设计一对引物 (扩增产物为 189bp) ,采用聚合链酶反应 单链构象多态性银染 (PCR SSCP)方法 ,以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照 ,检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpob基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析。结果　以药敏试验结果为对照 ,35株临床分离株中有 9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株 (H37Rv)相同 ,2 6株RFP耐药株中有 2 4检测到突变图谱 ,与药敏试验结果对照阳性率为 92 .3% ,特异性为 10 0 %。结论　rpob基因是一种高度保守序列 ,结核分枝杆菌耐RFP是由于rpob基因突变所致。本研究针对其高突变区域设计一对引物 ,运用PCR SSCP法具有简便、快速、准确的特点 ,可以对临床标本中结核分枝杆菌进行检测 。

摘要：目的探讨用低密度核苷酸薄膜导流杂交技术快速检测结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的可行性。方法根据MTB rpob基因设计12个野生型及常见突变型寡核苷酸特异探针,制作低密度核苷酸薄膜微阵列,通过导流杂交技术与薄膜杂交鉴定,并与DNA测序法对比。结果 81株MTB的耐药性试验及DNA测序结果显示,27株耐利福平MTB株中20株(74.1%)存在突变。以DNA测序结果为标准,31株标本(20株耐利福平MTB突变株,11株利福平敏感MTB野生株)低密度核苷酸薄膜导流杂交的敏感性为85%(17/20),特异性为100%(11/11),阳性预测值为100%(17/17),阴性预测值为78.6%(11/14);与DNA测序法的符合率为90.3%(28/31)。结论用低密度核苷酸薄膜导流杂交能快速、简便检测MTB,并可提示其是否对利福平耐药,指导临床合理用药。

摘要：目的　建立聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)检测结核分枝杆菌rpob基因突变的方法 ,并评价其临床应用的价值。方法　依据结核分枝杆菌rpob基因的耐利福平决定区设计引物 ,用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpob基因片段 ;对扩得的rpob基因片段做DNASSCP分析 ,并随机测定rpob片段的序列。结果　PCR从所有 2 12株结核分枝杆菌中均扩得 2 3 0bp片段 ,13 5份抗酸染色阳性的痰标本中 ,有 113份扩得阳性片段 ( 83 .7% )。在SSCP分析中 ,14 0份经L J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌 ,有 13 0份有rpob基因突变 (符合率为 92 .9% ) ,72份经L J药敏试验检测为利福平敏感的菌 ,有 67份的rpob基因无突变 (符合率为 93 .1% )。测序分析发现 5 7份经SSCP检测为突变的rpob片段均有序列改变 ,10份经SSCP分析为无突变的有 8份无序列改变 ,SSCP与测序结果的符合率为 94 .0 %。在本研究的菌株中 ,耐多药结核病 (MDR TB)占 76.4 % ( 10 7/14 0 ) ,有 92 .5 % ( 99/ 10 7)耐多药菌株经SSCP检测有rpob突变。结论　建立的PCR SSCP分析方法 ,是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpob基因突变的方法 ,可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性 ,并可作为MDR

摘要：目的:应用滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术以DNA芯片为载体建立一种对结核分枝杆菌耐药基因单碱基突变的快速检测方法。方法:根据结核分枝杆菌利福平耐药rpob基因序列,设计针对该基因常见突变位点的锁式探针,及固定于基因芯片上的捕获探针。针对临床结核分枝杆菌样本的基因组DNA,PCR扩增含有rpob基因常见突变位点的特异性DNA片段。将与突变型特异性互补结合并环化的锁式探针与芯片上固定的捕获探针进行杂交,并运用滚环扩增技术,将含有生物素标记的dUTP掺入扩增产物,最后通过与亲和素标记的纳米金反应,并银染增强显色。同时与临床样本的测序结果比较。结果:通过优化反应条件,能特异性的检测出结核分枝杆菌耐利福平rpob基因的单碱基突变,通过对临床样本的检测,结果与测序结果一致。结论:该方法结合了DNA芯片和滚环扩增技术,能够快速有效的检测出耐药结核的单碱基突变,具有高特异性、高灵敏度。

摘要：目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物，运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法，检测了４５株结核杆菌临床分离株，并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照，有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测，阳性占９３．３％，特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示，ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变，耐药株均发生碱基突变，分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便，快速，准确的特点，提高敏感性，可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。

摘要：摘要目的：探讨直接从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpob基因的方法。方法：（1）使用引物Primerl：5’-CGTACGGTCGGCGAGCTGATC-3’，与Primer2：5’-AGGGGTITCGATCGGGCACATC-3’；Primer3：5’-TGqTCTICAAGGAGAAGCG-3’．与Primer4：5’-TCGTCGGCGGTCAGGTA-3’分别扩增18株临床分离结核分枝杆菌的rpob基因，以检测引物设计的合理性。（2）分别采用普通PCR、TouchdownPCR、巢式PCR、二次PCR对直接从3＋～4＋抗酸染色痰涂片刮削物中提取的80例分枝杆菌基因组DNA进行rpob基因扩增。（3）对80例抗酸染色痰涂片刮削物基因组DNA行实时荧光定量PCR以检测其拷贝数。（4）对18例临床分离菌株基因组DNA10^0、10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7倍稀释物行实时荧光定量PCR与普通PCR（Primerl与Primer2。Primer3与Primer4），以比较二者检出限。结果：（1）两对引物对18株临床分离结核杆菌rpob基因扩增均有明亮目的条带，并经测序证实。（2）80例痰涂片刮削物基因组DNA扩增均未见目的奈带。（3）80例痰涂片刮削物基因组中．其中20例DNA的拷贝数为10z～10。copies／μL，60例DNA的拷贝数为10^4～10^5copies／μL。（4）两组引物能够扩增出rpob基因的最高稀释倍数分别为10^4、10^5倍，其对应的荧光定量PCR检测拷贝数分别为10。copies／IxL、107copies／μL。结论：从抗酸染色阳性痰涂片刮削物中扩增分枝杆菌rpob基因理论上可行，但在实际操作中尚存在-些问题有待进一步探索。抗酸染色涂片制作过程对基因提取及扩增的影响，痰涂片刮屑物基因组提取过程中多次离心造成的DNA量部分丢失均可能是本实验失败需要考虑的因素之-。

摘要：目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpob寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpob基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpob基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。

摘要：目的 ①证明单管半套式聚合酶链反应(PCR)是检测结核分支杆菌的特异性方法;②研究结核分支杆菌rpob基因突变与利福平耐药性的关系。方法 设计三条针对结核分支杆菌的特异性引物,采用单管半套式PCR-单链构象多态性(SSCP)方法对结核分支杆菌、其它分支杆菌和富含GC碱基的细菌进行分析。结果 ①结核分支杆菌标准菌株H_(37)Rv和55株临床分离株均扩增出一条193bp片段,其特异性为100％,敏感性约为10pgDNA;15株非结核分支杆菌和8株富含GC的细菌均未得到扩增;②55株结核分支杆菌临床分离株193bp扩增片段SSCP图谱特点:以H_(37)Rv为对照,15株利福平敏感株均无区别;40株耐药株除6株外其余34株SSCP图谱有明显区别,检测阳性率为85％。结论 单管半套式PCR检测结核分支杆菌简便、敏感、特异,结合SSCP可检出耐利福平结核分枝杆菌rpob基因突变,此突变与利福平耐药关系密切。