摘要：目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpob基因,了解利福平耐药的分子机制。方法根据结核分枝杆菌rpob基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpob基因片段,对扩增获得的rpob基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpob基因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpob基因点突变,突变位点主要为531、516或526常见密码子,且绝大多数为单碱基突变,发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpob基因及其突变,结核分枝杆菌对利福平的耐药性与rpob基因点突变有关。

摘要：目的　研制线性探针分析法检测结核分枝杆菌 (结核菌 )rpob基因耐药突变试剂盒。方法　设计 15条结核菌rpob基因野生型和突变型的线性探针 ,固定尼龙膜上 ;在rpob基因引物上标记生物素 ,扩增结核菌DNA ,获得生物素标记扩增产物 ,与rpob基因线性探针杂交 ,加入标记过氧化物酶的亲合素 ,再加四甲基联苯胺显色。结果　应用线性探针分析法检测 87株结核菌 ,其与rpob基因直接测序法、传统药敏法符合率分别为 98 8% (82 / 83)和 94 3% (82 / 87)。结论　线性探针分析法检测rpob耐药基因突变是一种操作简便、特异性高、敏感性高 ,易开展的方法。

摘要：为建立鸭源鸡杆菌(***)双重PCR检测方法,并对鸡杆菌分离株进行种类鉴定,本研究根据GenBank中*** 12656-12株的gtxA基因序列设计一对PCR引物,合成扩增rpob基因的引物作为内参基因,建立了***双重PCR检测方法。检测结果显示:以*** Yu-PDS-RZ-1-SLG株DNA为模板进行的双重PCR检测能够扩增出两条目的片段;其它16株细菌包括副鸡禽杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、福氏志贺菌和奇异变形杆菌均只扩增出了一条目的片段;该方法可以检测到浓度为6.5×102cfu/mL的***;34株鸡杆菌分离株均扩增出了两条预期大小的目的片段。此外,序列分析结果表明,10株鸡杆菌河南分离株的rpob基因序列与鸭源鸡杆菌种参考株(CCUG 15563)的同源性最高(97.5%～99.0%),属于鸭源鸡杆菌种。本研究建立的***双重PCR检测方法,可用于含gtxA基因鸡杆菌菌株的鉴定及临床病原学诊断。

摘要：目的利用焦磷酸测序技术,建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增 rpob 基因片段,经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板,设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测 rpob 基因耐药突变区的81 bp 序列突变情况,与 H_(37)Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌 rpob 基因突变检测平台,32株利福平耐药株均在 rpob 基因片段上检测到突变,22株利福平敏感株未检测到突变,检测结果与直接测序符合率达100%。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平 rpob 基因突变。

摘要：目的建立快速鉴别羊种布鲁菌1、2、3型的基因分型方法。方法根据羊种布鲁菌标准参考菌株16Mrpob基因的单核苷酸多态性和羊种布鲁菌基因组中串联重复序列（tandem repeat sequence，TRS）Bin42基因的差异，分别设计引物．建立鉴别羊种布鲁菌标准参考菌株的***和TRS-PCR方法．用建立的方法对临床分离的羊种布鲁菌进行鉴别。并与常规生物分型方法进行比较。结果rpob-PCR和TRS-PCR对羊种布鲁菌标准参考菌株（生物型1、2、3型）的鉴定结果与常规鉴定方法结果一致。51株临床分离羊种布鲁菌，rpob—PCR的鉴别结果显示，50株[包括1（17株）、2（3株）、3（30株）生物型]羊种菌均鉴别为rpob-2基因型，仅1株羊种1型菌鉴别为rpob-3基因型。生物型相同的标准参考菌株与临床分离菌株，基因型鉴定结果不完全一致。TRS-PCR的鉴别结果显示，51株羊种菌均鉴别为羊种2型布鲁菌（TRS-2基因型）。结论羊种布鲁菌生物型与基因型未见明显关联．羊种布鲁菌分离株与标准参考菌株的rpob基因存在显著差异，Bru42不能用于临床分离羊种布鲁菌的基因分型。

摘要：目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpob基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpob基因序列设计探针并制作DNA芯片,用TAMRA标记的引物扩增结核分枝杆菌rpob基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果240株结核分枝杆菌临床分离株中,55株全敏感株和66株耐其他药物的利福平敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同;119株耐RFP临床分离株中DNA芯片杂交有117株检测到rpob基因突变,其中111株单位点突变,78株为531位密码子TCG→TTG(Ser→Leu)、TCG→TGG(Ser→Trp)和TCG→TAC(Ser→Tyr)突变;24株为526位密码子CAC→TAC(His→Tyr)、CAC→GAC(His→Asp)、CAC→CCC(His→Pro)、CAC→CTC(His→Leu)和CAC→CGC(His→Arg)突变;4株为516位密码子GAC→GTC(Asp→Val)和GAC→GGC(Asp→Gly)突变;3株为533位密码子CTG→CCG(Leu→Pro)突变;1株为511位密码子CTG→CCG(Leu→Pro)突变;1株为513位密码子CAA→AAA(Gln→Lys)突变;6株为双位点突变,其中3株511和516位联合突变,2株533和515位联合突变,1株517位密码子CAG→CAC(Gln→His)和518位密码子AAC→GAC(Asn→Asp)联合突变。DNA测序结果与DNA芯片杂交结果完全一致。1株516位GAC-TAC(Asp→Tyr)突变的分离株及1株516位GAC-TAC(Asp→Tyr)和518位AAC-CAC(Asn→His)联合突变的分离株DNA芯片检测阴性,是因为芯片上无相应的探针。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpob基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。

摘要：目的　研制一种新型DNA芯片 ,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测。方法　根据结核分支杆菌rpob基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片 ,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpob基因突变热点的目的片段 ,与芯片杂交 ,同时以DNA测序法为对照。结果　 17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有 14株可用DNA芯片检测出来 ,效率可达 83%;患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测 ,无须进行培养。结论　用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度 ,该法快速、精确 。

摘要：目的评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值。方法用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测。以rpob基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ~2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性。用Kappa检测分析两种结果的一致性。结果药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株。以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36%,特异性为92.59%,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。

摘要：目的　建立一套等位基因特异性扩增 (ASA)的检测体系 ,用于结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。方法　根据结核分支杆菌野生型基因设计ASA特异性引物 ,ASAPCR扩增 39株结核杆菌利福平耐药株的rpob基因 ,经琼脂糖凝胶电泳检测 ,进而推断利福平的耐药性 ;同时进行DNA序列测定以验证ASA法的检测结果 ,并分析上海地区结核杆菌rpob基因的突变特点。结果　在 39株利福平耐药株中共检出 36株 ,敏感性为92 3% ;与DNA测序结果的符合率为 87.2 % ,并鉴定了 11种不同类型的 4 1种突变形式 ,其中包括 9种点突变和 2种基因缺失。结论　用等位基因特异性扩增法分析结核分支杆菌的rpob基因突变具有较高的特异性与敏感性。该法快速、简便、可靠 ,可应用于临床利福平耐药性的检测。

摘要：目的建立一种快速初筛结核分枝杆菌(结核菌)耐多药性的方法。方法设计一种能检测已知点突变的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)方法并优化试验条件,用此方法检测18株耐多药株及95株非耐多药株的rpob基因531位密码子由TCG向TTG的突变情况,以检测其耐多药性。以传统的间接耐药比例法为标准,对用PCR法检测结核菌的耐多药性的灵敏度、特异度和约登指数等指标进行评价。结果本研究设计的PCR法检测结核菌耐多药性的灵敏度为89%,特异度为80%,约登指数为69%。结论本研究设计的PCR法2小时能报告结果,且简单、经济,在结核菌耐多药性快速初筛中具有应用潜力。