摘要：目的：构建microRNA-21、PTEN基因真核表达载体pEGFP-N1-pre-试勉1、pEGFP-NI-PTEN及shrna表达载体Psilencer4．1-CMV-mir21-shrna、Psilencer4．1-CMV—FrrEN--shrna。方法：根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shrna及PCR引物。

摘要：目的构建小鼠整合素β1的shrna表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shrna表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shrna表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shrna表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shrna表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。

摘要：目的:设计并构建靶向mdr1基因shrna真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shrna表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shrna表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

摘要：目的:以pGenesil-1质粒为介导,构建针对MBP基因的shrna表达载体。方法:设计特异性表达MBP shrna结构的互补DNA序列3个及1个阴性对照序列,退火并克隆至质粒载体pGenesil-1中,转化DH5α菌株,进行重组质粒的酶切鉴定及测序分析。结果:经酶切鉴定及测序分析,筛选出的重组体测序结果和靶序列相同,成功构建了shrna重组质粒载体pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3及pGenesil-1-MBP-neg。结论:成功构建MBP shrna表达载体,为进一步研究MBP基因在细胞中的作用机制奠定基础。

摘要：目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。

摘要：目的:探讨乙酰肝素酶shrna抑制人卵巢癌细胞系乙酰肝素酶(HPSE)表达及对其侵润侵袭能力的影响。方法:针对HPSE mRNA的不同区域设计并构建不同的shrna表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳定转染细胞株,分别用RT-PCR和Western blot检验HPSE mRNA和蛋白表达受抑制情况,分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验测定细胞增殖能力,分别采用Matrigel Invasion,Transwell Migration和Adhesion Assay方法测定细胞体外侵袭、迁移和黏附能力。结果:用荧光定量PCR对不同shrna干扰载体的干扰效果进行检测,结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比,差异有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达SKOV3细胞系,经RT-PCR和Western blot检验其HPSE表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,差异无统计学意义(P>0.05)。迁移能力实验中,干扰组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞黏附能力高于对照组(P<0.05)。侵袭能力实验干扰组低于对照组(P<0.05)。结论:采用构建shrna干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,降低了卵巢癌细胞侵袭能力,黏附能力增强。

摘要：目的:设计并构建靶向NEDD4-1基因shrna真核表达质粒。方法:依据靶基因序列设计siRNA,克隆入pGPU6/GFP/Neo载体U6启动子的下游,建立shrna表达质粒系统,采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:将重组NEDD4-1 shrna用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切。经酶切鉴定、测序分析,序列完全正确。结论:成功构建NEDD4-1 shrna真核表达质粒,为进一步研究NEDD4-1在胶质瘤发生和发展中的作用提供实验基础。