摘要：目的观察sirna沉默NPM基因的表达对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖活性及细胞周期的影响。方法培养A431细胞,针对NPM mRNA序列设计合成特异性sirna,转染A431细胞;采用实时定量PCR(Real-timePCR)法检测NPM基因的表达情况,CCK8法检测细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞周期变化。结果实时定量PCR法的结果显示:细胞NPM基因的表达受到明显抑制,并筛选出沉默效率最高的特异性sirna片段进行后继实验;CCK8法检测结果显示NPM基因沉默后,细胞增殖活性显著降低(P<0.05);流式细胞术检测结果显示细胞发生S期阻滞,G2/M期细胞减少。结论沉默NPM基因的表达可明显抑制A431细胞的增殖活性,并导致细胞周期阻滞。提示NPM基因可能成为皮肤肿瘤防治的调控靶点。

摘要：目的应用特异性sirna抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kir3.1基因表达;筛选出干扰效率最高的sirna,并应用分子生物学方法进行鉴定。方法设计并化学合成3条针对Kir3.1基因的sirna,脂质体法转染原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞,应用Real-time PCR筛选出抑制效率最高的sirna,将其转染入细胞;于转染后24h、48h、72h提取细胞总RNA及蛋白质,分别采用Real-time PCR和Western blot检测Kir3.1 mRNA及蛋白质表达情况。结果 Real-time PCR显示sirna-3干扰效率强于sirna-1,2,能够显著下调心房肌细胞Kir3.1 mRNA的表达;sirna-3转染心房肌细胞后,发现其在24,48,72h均能使Kir3.1 mRNA及蛋白表达下降。结论针对Kir3.1 mRNA合成的sirna能够特异性干扰Kir3.1基因表达和蛋白质的合成,这可能为心律失常性疾病的治疗提供新的实验性依据。

摘要：目的以骨桥蛋白(OPN)为分子靶点,观察经动脉外膜转染sirna-OPN对球囊损伤后大鼠颈动脉内膜损伤后局部内膜增生的影响。方法设计并合成了3对大鼠sirna-OPN,应用实时PCR的方法,分别检测其对原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞OPN-mRNA表达的影响,筛选出其中最敏感的sirna-OPN-002序列作为转染基因。利用球囊损伤的方法制备大鼠颈动脉内膜损伤模型后,应用30%pluronic gel溶液经血管外膜局部转染OPN-sirna,应用免疫组化、实时PCR、Western印迹等检测转染OPN-sirna-002后,OPN的表达变化,以及抑制血管内膜增生的作用。结果经动脉外膜转染Cy3标记的sirna后,可见Cy3-sirna分布于血管壁内,转染sirna-OPN-002后,其OPN的mRNA和蛋白的表达水平与转染SCR-sirna和对照组比较,在各个时间点上均显著降低(P<0.001),并且这种下降趋势一直持续到实验结束的14d,其内膜的增生也受到了明显的抑制(P<0.001)。结论经动脉外膜转染OPN-sirna-002可持续明显地抑制大鼠动脉内膜损伤后局部细胞的OPN mRNA和蛋白表达,具有抑制内膜增生作用,OPN可望成为防治血管再狭窄的重要的靶分子。

摘要：目的探讨sirna抑制脾酪氨酸激酶(syk)基因后对外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78细胞增殖与凋亡的影响。方法针对syk基因特异靶点设计3条sirna(sirna-1、sirna-2和sirna-3),采用电穿孔法转染外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78,同时设Mock组和sirna-NC组,转染48 h后,分别用RT-PCR和Western blot技术检测syk mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最有效的syk sirna;syk sirna转染HUT-78后分别用软琼脂克隆形成实验检测syk下调后HUT-78细胞的克隆形成能力,MTT法检测干扰24、48、72 h后细胞增殖情况,流式细胞术检测syk下调后HUT-78细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR和Western blot结果显示,与Mock组和sirna-NC组相比,3条sirna均能有效降低HUT-78细胞中syk mRNA和蛋白的表达,其中syk sirna-1抑制效果最明显。克隆形成实验显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的克隆形成能力与Mock组相比明显下降(P<0.05);MTT实验结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的增殖能力与Mock组相比显著下降(P<0.05);流式细胞术结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的凋亡比例明显高于Mock组(P<0.05)。结论 sirna下调syk基因表达后可抑制外周T细胞淋巴瘤细胞的增殖、克隆形成,促进凋亡,推测syk基因在外周T细胞淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用,有可能成为外周T细胞淋巴瘤基因治疗的新靶点。

摘要：目的研究趋化因子受体CXCR2的sirna质粒构建及对裸鼠移植宫颈癌的抑制作用。方法将通过人源CXCR2的基因序列设计的sirna和质粒p DC316-EGFP-U6通过内切酶链接,同时引入胆固醇修饰,将重组质粒免疫建立好的裸鼠模式动物,通过测算评价重组质粒的治疗效果。结果琼脂糖凝胶电泳发现重组质粒大小正确,浓度合适;经过28 d的治疗,空白对照组和空质粒对照组肿瘤体积生长比较无差异(P>0.05);重组质粒治疗组的效果明显,与前两组比较差异显著(P<0.01),并且重组质粒治疗组的抑瘤率达到50%;荧光显微镜观察增强绿色荧光信号,产生荧光的细胞约占总细胞的8%,体内转染效果明显。结论经过本实验设计和构建的重组质粒对趋化因子受体的表达具有抑制作用,在裸鼠模式动物治疗效果中具有重要意义。

摘要：目的比较补中益气汤含药血清与sirna技术(RNA)对人肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的耐药效果及对多药耐药蛋白P-gp表达的影响。方法制备补中益气汤含药血清,设计并合成针对P-gp基因对应序列的sirna,转染A549/DDP细胞;实验分组为空白对照组、补中益气汤含药血清处理组、sirna处理组,利用RT-PCR检测P-gp mRNA,Western印迹及免疫细胞化学法检测P-gp蛋白质的表达;MTT法检测A549/DDP细胞耐药逆转效果。结果补中益气汤含药血清和sirna均能降低P-gp mRNA和蛋白质表达,恢复顺铂敏感性,耐药倍数分别降至2.01、2.73,具有统计学意义(P<0.05)。结论补中益气汤含药血清和sirna均能有效逆转人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的多药耐药。

摘要：有效sirna的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://***的靶位点筛选和设计工具,选取4个sirna序列(sirna95、sirna179、sirna218和sirna294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效sirna,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效sirna片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的sirna。

摘要：目的观察cubilinsirna真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用。方法针对人cubilin基因设计并构建sirna真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC24h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化。结果FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性。与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少。结论成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型sirna可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取。

摘要：目的:研究RNA干扰(RNAi)对人脑胶质细胞瘤(U251)中Moesin蛋白基因表达的抑制作用及其对U251细胞生长、侵袭的影响.方法:以人脑胶质细胞瘤U251细胞系为研究对象,针对Moesin编码基因设计小干扰RNA(sirna)片段,转染入细胞,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)筛选沉默效率最高的sirna片段,并用WesternBlot技术检测定量转染后U251细胞Moesin蛋白的表达水平.转染后以MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞的凋亡水平;Transwell法检测侵袭能力的变化,并以扫描电镜观察转染后的细胞形态变化.结果:RT-PCR,WesternBlot筛选出的MOESIN-139片段沉默效果最好,sirna转染后U251细胞生长速度减慢,在转染48h时,sirna组U251细胞生长速度明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),平均凋亡率sirna组为(17.30±2.01)%,远高于空白对照组(1.95±0.33)%和阴性对照组(2.02±0.28)%(P<0.01).sirna转染后的U251细胞穿过聚碳酯膜的细胞数量明显减少,由空白对照组26.47±4.07,阴性对照组24.27±3.63下降至sirna组11.53±2.61(P<0.01).细胞形态发生改变,细胞表面伪足数由空白对照组14.20±2.58,阴性对照组15.80±1.30下降至sirna组6.60±1.82(P<0.01).结论:sirna可下调Moesin的表达,并能有效抑制U251细胞的生长,减低其侵袭性.Moesin有可能成为治疗人脑胶质瘤的靶点分子.

摘要：目的:构建针对钙转运蛋白(CaT1)特异性干扰RNA(sirna)及其表达载体,并检测其对CaT1基因的干扰作用。方法:设计CaT1靶向的发夹状sirna,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSilencer3·1-H1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体转染法转染人类胃癌细胞BGC,通过RT-PCR检测CaT1基因表达水平的变化。结果:酶切鉴定与DNA测序分析证明CaT1基因的sirna载体构建正确,RT-PCR结果表明CaT1基因的表达水平明显降低。结论:成功地构建了针对CaT1基因的sirna载体,转染细胞后可抑制CaT1基因表达。