摘要：新型冠状病毒是严重急性呼吸道综合征 (SARS)的病原体 ,目前缺乏有效预防和治疗药物。作者在研究SARS冠状病毒基因的基础上 ,借鉴近年迅速发展的sirna (smallinterferingRNR)基因药物的思路 ,经过对制剂和给药途径的分析 ,提出针对SARS有效、安全、特异的sirna药物设计策略。通过PEI -sirna质粒复合物的喷雾给药 ,将该药物靶向性地导入肺部 ,进入肺部细胞并表达特异性的sirna ,对已经感染病毒的细胞内部的病毒基因进行沉默 ,抑制病毒的进一步复制和繁殖 ,既达到治疗目的 ,且克服sirna药物中靶向性和导入性差的两大困难 ,提供了一条安全。

摘要：目的:设计并筛选能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌Caco2细胞、人胃癌SCG-7901细胞增殖的增殖细胞核抗原(PCNA)sirna。方法:总结以往提出的sirna设计原则的基础上,设计4条PCNAsirna,体外转录合成PCNAsirna;并作用于3种肿瘤细胞,WST-8法检测细胞增殖活性,筛选能有效抑制肿瘤细胞增殖的sirna序列;RT-PCR检测细胞PCNA mRNA水平;免疫细胞化学方法检测PCNA蛋白表达水平。结果:4条PCNA sirna中,有3条序列(No.2、No.4、No.3)的sirna能有效抑制3种肿瘤细胞的增殖;其中No.2、No.4作用效果最优,以50 nmol/L浓度作用48 h,对3种肿瘤细胞的增殖抑制率均可达到62%以上,No.2、No.4 PCNAsirna均能在mRNA和蛋白水平显著下调PCNA的表达。结论:PCNA sirna能在体外有效抑制SMMC-7721细胞、Caco2细胞、SCG-7901细胞的增殖,其适宜作用浓度为50 nmol/L,适宜作用时间为48 h。

摘要：目的 观察sirna干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性sirna分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/Neosirna重组质粒.构建重组表达质粒pET22b＋/mexB,并转化大肠杆菌BL21（ DE3） plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.sirna质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-sirna重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.sirna质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 sirna质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.

摘要：目的:探讨靶向人端粒酶基因hTERT对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生长增殖的抑制作用。方法:根据人端粒酶基因hTERT设计和合成人端粒酶sirna和随机的siN.C作为阴性对照,通过转染载体Lipofectamine 2000脂质体转染Hep-2细胞,进行形态学、RT-PCR和MTT法检测,观察其干扰效果。结果:①sirna能够成功转染进入Hep-2细胞;②RT-PCR结果显示转染组与阴性对照组和空白组相比,hTERT mRNA表达明显减弱,转染组hTERT mRNA较空白组相对下降70%;③形态学和MTT结果显示人端粒酶sirna能有效抑制Hep-2细胞增殖,抑制率达到65%。结论:靶向hTERT的sirna能显著抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的生长增殖。

摘要：该研究在验证小鼠睾丸支持细胞TM4有内源性uPA基因表达的基础上,针对uPAmRNA靶序列设计三段不同的sirna序列(si-uPA),通过瞬时转染TM4细胞,筛选确定uPA基因的有效干扰序列。将该有效干扰序列进行时效、量效实验,观察sirna对TM4细胞uPA mRNA和蛋白表达的影响。结果显示,sirna的最佳转染浓度为50 nmol/L。三种si-uPA转染TM4细胞后,uPA mRNA和蛋白表达量均较空白对照组明显下降(P<0.05),以si-uPA1作用最为明显。si-uPA1转染24 h后,转染组细胞uPA mRNA的表达均较对照组显著降低,其中100 nmol/L组抑制效果最为明显,抑制率达到70%;随转染时间的延长,uPA mRNA表达持续降低,转染72 h后,三组转染细胞uPA mRNA表达量分别为对照组的53.9%、35.3%和27.7%(P<0.05)。该研究成功筛选出针对uPA mRNA靶序列的有效干扰序列,抑制效应持续至72 h;同一时间点内,抑制效应随转染浓度的增加而增强,表现出良好的量效关系。

摘要：目的:筛选特异性抑制人-单核巨噬细胞TLR2基因表达的sirna(small interference RNA)序列,在分子水平上初步讨论其在HIV治疗方面的前景。方法:在基因库中寻找TLR2基因的mRNA序列,针对TLR2基因设计并合成3条sirna,阳性对照为人类看家基因GAPDH sirna,阴性对照为6-羧基荧光素标记的sirna(NC-FAM)。采集健康人新鲜外周血,分离单个核细胞,再经贴壁法培养纯化为人-单核巨噬细胞。采用阳离子脂质体试剂Lipofectamine 2000介导转染培养的人-单核巨噬细胞。用q-PCR法测定干扰后单核巨噬细胞的TLR2 mRNA的表达,Western blot法测定干扰后TLR2蛋白表达。结果:转染72 h后,阳性对照组GAPDH mRNA及蛋白的表达明显降低(P<0.05)。sirnas组TLR2 mRNA表达水平整体有显著性差异(F=41.957,P<0.001),与阴性对照组比较,TLR2 sirna各组的TLR2 mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),抑制率分别为46%、43%、43%。WB结果显示,TLR2 sirna各组的TLR2蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论:本研究设计的sirna能够有效抑制人-单核巨噬细胞TLR2基因的表达,从分子免疫学角度出发,表明通过阻断sirna介导的TLR2信号传导通路能够为HIV治疗提供新思路。

摘要：目的筛选特异性干扰人BMP9基因的sirna序列并制备重组腺病毒AdsiBMP9,探讨RNAi人BMP9基因后对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖能力的影响。方法设计制备3对干扰人BMP9的双链DNA序列,亚克隆至Pses-Hus质粒中获得Pses-Hus-siBMP9质粒,脂质体转染乳腺上皮细胞HBL-100筛选有效干扰质粒,构建重组腺病毒并感染SK-BR-3细胞,RT-PCR,Western blot检测BMP9表达,MTT检测细胞增殖能力。结果成功构建并筛选出针对人BMP9基因的有效干扰质粒并包装成腺病毒,病毒滴度为1×1010IU/mL,感染SK-BR-3细胞显示BMP9在转录水平和翻译水平表达量显著低于对照组和空白组(P<0.05),第5天AdsiBMP9组细胞的增殖率显著高于AdsiNC组(P<0.05)。结论成功构建特异性沉默人BMP9基因的sirna腺病毒载体,可有效抑制SK-BR-3细胞中BMP9基因的表达从而促进该细胞增殖。

摘要：本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(sirna),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。sirna既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性sirna转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:sirna可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。

摘要：HMGA2是一种结构性转录因子,在肺癌等多种肿瘤中过表达,是肿瘤治疗的候选靶点之一。RNAi技术作为一种经济、有效的基因沉默工具,是肿瘤治疗的新手段。本文以Hmga2基因为靶点,设计并合成了5条sirna(HMGA2 sirna1-5),通过MTT、平板克隆、Transwell、流式细胞术等手段,研究其对肺癌细胞(NCI-H446和A549)增殖、克隆形成、迁移和凋亡等能力的影响。结果表明,HMGA2 sirna1、3、5对肺癌细胞的各项性能具有不同程度的影响,其中HMGA2 sirna5尤为明显。HMGA2 sirna5主要通过沉默Hmga2基因影响细胞性能,与其干扰素效应关系不大。本文筛选获得了可有效沉默Hmga2基因的sirna,其在体外具有良好的抗肺癌活性,是具有一定潜力的肿瘤基因治疗候选药物。

摘要：目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,sirna)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计sirna序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及sirna序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录sirna。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染sirna后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而sirna阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论sirna可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。