摘要：以toxr基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxr基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。

摘要：选择lolB和toxr两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxr两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。

摘要：基于副溶血弧菌toxr基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。

摘要：对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxr基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxr基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank(登录号为EF693743)。首次获得拟态弧菌840bptoxr基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxr基因有87%—88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxr基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxr基因有45%的相似性。该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区。系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxr基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来。toxr基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxr基因调控的致病基因。

摘要：为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxr基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。

摘要：基于toxr基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxr基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μl的哈氏弧菌基因组DNA。该试验建立的基于toxr基因的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测。

摘要：基于河流弧菌的toxr基因设计了6对引物,分别为F1、F2、F3、F4、F5、F6。以标准河流弧菌HL01、HL02、HL03、HL04做梯度PCR检测。试验结果表明,仅F2和F4能获得分子量分别为332 bp和358 bp的目的条带。利用其他27株非河流弧菌进行PCR特异性检测,结果表明,引物F2和F4的特异性较强,但F2和F4这两对引物的灵敏度也有一定的差异,F2的灵敏为9.3×103cfu/ml,F4的灵敏度为9.3×102cfu/ml。

摘要：建立一种针对副溶血弧菌bla_(CARB-17)和toxr基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxr基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃30 s,引物比例1∶1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxr基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×10~2 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。

摘要：本研究选择副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxr和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的rtxA基因序列设计2对特异性引物,建立了在同一反应体系中同步检测2种病原菌的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为368bp和417bp。特异性试验结果表明,在同一反应体系下,副溶血弧菌和霍乱弧菌扩增出目的条带,其他4种对照病原细菌无任何扩增条带;单一及双重PCR敏感性试验结果表明,稀释浓度在(109～102)CFU/mL,单一PCR与双重PCR均可扩增出目的条带,且单一PCR与双重PCR表现出了相同的灵敏度(102 CFU/mL),表明本实验优化的双重PCR反应条件良好;人工染菌样品均可扩增出两条目的条带,表明该方法可直接用于针对病原副溶血弧菌和霍乱弧菌感染的水生动物疾病的检测以及水产品的安全检测,在水产品致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。

摘要：目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxr(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxr基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxr基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102cfu/mL。结论该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。