摘要：近年来,番鸭细小病毒出现新的流行趋势,估计与病毒基因变异有关,因此针对新流行毒株研发新的检测方法很有必要。本研究根据番鸭细小病毒(MDPV)2012年分离株SAAS-SHNH的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长vp3基因,经鉴定正确后,进行同源性比对分析,同时将其克隆到PET28a载体,构建成PET28a-vp3原核表达载体,经转化及IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,表达出与预期大小相符的63.1 k Da的蛋白,该蛋白可与临床采集的免疫过MDPV的番鸭血清结合,说明该蛋白可用于MDPV的血清学检测。将纯化后蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源MDPV-vp3蛋白的多克隆抗体,制备的兔源血清能够与MDPV疫苗弱毒株及J3D6株vp3蛋白发生特异结合;MDPV感染原代鸭胚成纤维细胞(DEF)后,利用兔源血清作为一抗进行免疫荧光分析(IFA)分析,在DEF细胞核和细胞质内均能检测到vp3蛋白,表明利用vp3蛋白制备的抗血清可以用于MDPV免疫荧光分析细胞增殖病毒的检测。这为今后MDPV的快速检测提供了技术基础。

摘要：根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株vp3基因,测序后将vp3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-vp3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性。

摘要：为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白vp3,首先根据DHAV-I SH株vp3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出vp3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-vp3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-vp3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-vp3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白vp3在昆虫细胞中获得了成功表达,为vp3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。

摘要：根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白vp3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将vp3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-vp3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,vp3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含vp3基因的GPV真核表达载体pVAX1-vp3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。

摘要：根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPVGD-01株的vp3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM○R-T后测序,分析了GPV GD-01株vp3基因的遗传变异情况,并进行原核表达。结果表明,GPV GD-01株vp3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV vp3基因具有较高的遗传稳定性。结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV vp3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础。原核表达显示,vp3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性vp3表达蛋白。SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的vp3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础。

摘要：根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了vp3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株vp3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;

摘要：参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白vp3基因,并将vp3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化*** Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

摘要：目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的vp3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆vp3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的vp3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的vp3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。

摘要：参考GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)全基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增了DHV-Ⅰvp3基因,将vp3基因与pET-28a(+)表达载体连接后,转化宿主BL21(DE3),用0.1 mmol·L-1的IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。电泳结果表明,vp3在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为27 kD。免疫印迹试验表明Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

摘要：为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株vp3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBLJ株vp3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-vp3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测vp3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察vp3基因表达水平。结果显示,克隆的vp3基因全长约1 605bp,构建了真核表达载体pcDNA-vp3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示vp3基因在Vero细胞中获得了稳定表达。本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。