摘要：目的筛选多胺代谢关键酶精胺氧化酶小分子抑制剂,并评价其对人肺癌A549细胞的精胺氧化酶活性抑制效应、抗肿瘤作用及分子机制。方法以精胺和精胺氧化酶复合物结构为基础,用计算机辅助药物设计技术,在化学数据库中虚拟筛选获得候选的小分子抑制剂。以A549细胞为肿瘤细胞模型,利用化学发光法、HPLC法分析小分子抑制剂对精胺氧化酶活性抑制及多胺含量的影响;采用MTT法、流式细胞术检测小分子抑制剂对细胞增值、细胞周期、诱导细胞凋亡的影响;在倒置荧光显微镜、透射电子显微镜下观察小分子抑制剂诱导细胞自噬小体的形成;Western blot法分析小分子抑制剂对细胞周期蛋白(Cyclin B1、p21、Cyclin D)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、细胞色素C)和自噬相关蛋白(LC3、P62)表达的影响。结果筛选出有效抑制精胺氧化酶活性的新型小分子抑制剂SI-1338,对精胺氧化酶的半数抑制浓度为880μmol·L^(-1)。SI-1338可有效抑制A549细胞中精胺氧化酶活性,干扰多胺代谢,减少总多胺的含量;抑制A549细胞的增殖,周期蛋白Cyclin B1、p21、Cyclin D表达增加,细胞被阻滞在G_(0)/G_(1)期;A549细胞中Bax的表达增加,Bcl-2的表达减少,细胞色素C的释放增多,凋亡细胞的数量增加;LC3-Ⅱ片段增多,P62蛋白的表达量明显减少,诱导A549细胞中自噬小体形成增加。结论筛选获得新的小分子抑制剂SI-1338。该抑制剂对A549细胞具有高效抗肿瘤效应,其分子机制可能与抑制精胺氧化酶活性、干扰多胺代谢、诱导凋亡和自噬发生相关,有望作为以多胺代谢为靶点的抗肿瘤药物先导化合物。

摘要：腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的基因治疗在单基因遗传性疾病的临床治疗中取得了突破性进展。通过衣壳蛋白修饰来优化AAV载体,获得具有细胞靶向性、高转导能力和低或无免疫原性的AAV载体成为当前基因治疗研究的重点之一。目前,研究者主要通过合理设计、定向进化和化学修饰方法对AAV衣壳进行修饰、改造。本文综述了AAV的生物学特性和有关AAV衣壳修饰的新近研究进展,并讨论了该领域所面临的挑战。

摘要：目的原核表达和纯化腺相关病毒(AAV)衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组(1只/组),实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。

摘要：目的:探讨在人宫颈癌Caski细胞中抑制多胺调节因子-1(polyamine-modulated factor,PMF-1)表达对糖皮质激素类药物地塞米松(dexamethasone,DEX)抗肿瘤作用的影响。方法:设计合成靶向人PMF-1基因的si RNA,Western blotting法鉴定其对Caski细胞PMF-1中表达的影响。用DEX处理PMF-1表达抑制的Caski细胞和对照细胞,然后分析PMF-1表达下调是否影响瘤细胞对DEX的敏感性。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,Western blotting法测定糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR)的表达水平,高效液相色谱法分析细胞内的多胺含量。结果:用靶向PMF-1基因的siRNA瞬时转染Caski细胞能显著性下调细胞中PMF-1蛋白的表达水平。与对照细胞相比,用DEX处理PMF-1表达下调的Caski细胞能更有效地抑制细胞增殖(P<0.01),上调细胞内GR表达水平(P<0.01),并显著抑制细胞分裂导致G2周期阻滞(P<0.01),同时能显著性地降低细胞内的多胺水平(P<0.01)。结论:抑制PMF-1表达可增强DEX对人宫颈癌细胞的抗肿瘤活性,其机制可能与降低细胞内多胺水平和增强细胞周期阻滞相关。

摘要：目的人工设计制备多价EZH2肿瘤相关抗原肽,并鉴定其抗原特性。方法设计合成编码多价EZH2肿瘤相关抗原肽的DNA序列,克隆入原核表达载体p ET-30a(+)中,构建含4个EZH2肿瘤相关抗原肽段(Aa120-128、Aa165-174、Aa291-299、Aa735-742)的重组多价抗原肽原核表达质粒p ET-30a(+)-EZH2-antigen,转化*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,用Ni-NTA树脂在变性条件下对重组多肽进行亲和层析纯化,Western blot分析重组多价EZH2肿瘤相关抗原肽的抗原特性。用重组多价EZH2肿瘤相关抗原肽免疫大耳白兔,制备多克隆抗体,间接ELISA法检测血清中抗体效价,Western bolt分析多抗的特异性。结果重组原核表达质粒p ET-30a(+)-EZH2-antigen经酶切及测序证实构建正确;表达的重组多价EZH2肿瘤相关抗原肽表观相对分子质量约4 300,主要以包涵体形式存在;纯化的多肽纯度不低于90%,浓度为0.5 mg/ml,且能被兔抗EZH2多抗和兔抗His标签多抗有效识别和结合;纯化的多价EZH2肿瘤相关抗原肽能在动物体内高效诱导抗体生成,抗血清效价为1∶64×104,且能特异性识别和结合PC3人前列腺癌细胞中表达的EZH2蛋白。结论成功制备了一种多价EZH2肿瘤相关抗原肽,该多价抗原肽相对分子质量虽小,但抗原肽密度高,可能具有更强的肿瘤相关抗原的活性,具有重要的应用前景。

摘要：肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤细胞的发生、生长、侵袭和转移方面起到了重要作用,其功能特性类似M2型巨噬细胞。目前多项研究表明TAM与血液系统恶性肿瘤的临床表现及预后相关。基于TAM的促肿瘤作用,目前针对TAM的活化、招募、促血管生成活性、存活及基质重塑等方面设计的靶向治疗药物也进入了基础或临床试验。