摘要：中医病因病机理论研究是以指导中医正确认识疾病的发生发展、提高中医药临床疗效为目的。其特点是整体宏观性、临床实践性及概念的抽象性。针对中医病因病机理论的本质特征及其发生发展规律,探讨现阶段病因病机理论研究的方法学及如何创新和发展中医理论。论述了坚持中医自身的思维方法与研究思路,紧密结合现代科学设计思路与技术方法,"病-证(方)-效结合"及"临床-药理-病理"综合研究设计等中医学理论创新研究的思路问题。

摘要：目的探讨虫草多糖对肝细胞凋亡的影响和作用机制。方法以人正常肝细胞L02作为研究对象,将不经任何药物处理的人正常肝细胞L02作为正常组;利用不同浓度的TNFα(5、10、20、40 ng/ml)进行干预24 h后筛选肝细胞凋亡模型的造模条件并作为模型组;根据实验设计,使用3种不同浓度的虫草多糖(50、100、200μg/ml)预作用12 h后给予或者不给予筛选后的TNFα模型浓度24 h作为实验组,收取样本进行检测,采用CCK8法检测细胞增殖活力;采用Annexin V/PI双染法检测肝细胞凋亡数;采用RT-PCR法检测细胞凋亡(Bax、caspase3、caspase8、caspase9、死亡受体Fas)的mRNA表达;采用蛋白免疫印迹法检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase8蛋白表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验,进一步两两比较采用LSD-t检验或Dunnett-t检验。结果CCK8法检测结果显示,40 ng/ml的TNFα诱导L02肝细胞24 h后,L02肝细胞增殖较正常组显著降低(73.54%±14.19%vs 100.00%±23.61%,P<0.01),3种不同浓度的虫草多糖在对肝细胞无明显细胞毒性的前提下,较模型组(93.02%±7.21%),细胞增殖均显著升高(P值均<0.01),分别为108.10%±9.05%、114.30%±8.79%、117.70%±9.66%。Annexin V/PI双染法检测结果显示,与正常组细胞凋亡数量比较,模型组细胞凋亡数量显著升高(7.71%±1.20%vs 11.57%±1.41%,P<0.05),3种不同浓度的虫草多糖较模型组(18.91%±0.80%)均明显降低细胞凋亡数量,分别为15.16%±0.16%、13.28%±1.57%、16.91%±0.21%(P值均<0.05)。RT-PCR法和蛋白免疫印迹检测结果显示,40 ng/ml TNFα造模后细胞凋亡相关的Bax、死亡受体Fas的mRNA表达较正常组均增强,差异均有统计学意义(P值均<0.05),并且激活形式的cleaved-caspase3、cleaved-caspase8的蛋白表达显著增强(P值均<0.05),与模型组比较,50μg/ml的虫草多糖可显著降低Bax、caspase3、caspase9的mRNA表达和cleaved-caspase8蛋白表达,100μg/ml的虫草多糖可显著降低Bax、caspase3、caspase8、Fas、caspase9 mRNA和cleaved-caspase8蛋白表达,200μg/ml的虫草多糖可显著降低caspase3、caspase8、Fas、caspase9 mRNA和cleaved-caspase3、cleaved-caspase8蛋白表达,3种虫草多糖浓度作用具有一定量效趋势。结论虫草多糖可以有效抑制TNFα诱导的L02正常肝细胞凋亡。

摘要：目的探讨扶正化瘀方成分配伍(PA方)抗CCl_(4)诱导的小鼠肝纤维化的治疗作用。方法采用CCl_(4)诱导的6周小鼠肝纤维化模型,运用均匀设计法以肝组织Hyp水平和天狼星红染色胶原面积为评价指标,获得PA方最佳配比,再对PA方作5个剂量水平的量-效实验,明确PA方最佳剂量和配伍效应。结果均匀设计实验表明,与模型组比较,PA5组小鼠血清ALT、AST活性降低(P<0.01),肝组织炎性损伤减轻,肝组织Hyp水平和天狼星红染色胶原面积降低(P<0.01)。量-效实验表明,PA方量-效关系呈非线性,与模型组比较,1/4 PA组小鼠肝组织炎性损伤减轻,肝组织Hyp水平和天狼星红染色胶原面积降低(P<0.01)。当PA方剂量高于1/4 PA时,PA方量-效关系在一定剂量范围内呈减弱态势。配伍效应实验表明,与模型组比较,PA方组小鼠肝组织Hyp水平和天狼星红染色胶原面积降低(P<0.01),并优于其成分丹酚酸B和苦杏仁苷单用(P<0.05);PA方可降低模型小鼠肝组织α-SMA、Desmin、Col-Ⅰ的表达(P<0.05),抑制TGF-β1/Smad3信号通路活性(P<0.05)。结论PA方具有显著的抗CCl_(4)诱导的小鼠肝纤维化作用,量-效关系呈非线性,其部分作用机制可能是抑制TGF-β1/Smad3信号通路活性,抑制HSCs细胞的活化。

摘要：目的:探索具有显著抗酒精性肝损伤作用的中药复方健脾活血方抗脂质过氧化的主效应中药,并分析相关作用机制。方法:采用均匀设计法及Lieber-DeCarli乙醇液体饲料诱导的大鼠乙醇性肝损伤模型,以肝组织丙二醛(MDA)含量作为效应指标筛选主效应中药,并再次以该模型验证其药效;进一步检测肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及血清铁离子(Fe2+)含量以分析主效应中药抗脂质过氧化的机制。结果:含8味中药的健脾活血方中"抗脂质过氧化"主效应药物组合为:葛根、泽泻、五味子、姜黄(剂量比为250∶50∶17∶50),验证及药理分析实验显示:与模型组相比,抗脂质过氧化主效应中药组肝组织MDA,NOS,iNOS及血清Fe2+含量显著降低,SOD,GSH-Px活性显著升高。结论:健脾活血方8味中药中对大鼠乙醇性肝损伤模型"抗脂质过氧化"的主效应中药组合为"葛根+泽泻+五味子+姜黄",其药理机制在于抑制促氧化物质NOS,iNOS及血清Fe2+产生,增加抗氧化自由基清除酶SOD,GSH-Px活性。

摘要：目的:探讨有显著抗酒精性肝损伤和肠道损伤作用的中药复方"健脾活血方"中改善肠道通透性作用的主效应中药,探索中药复方药理作用相应物质基础的分析方法。方法:采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料(6周)诱导的大鼠酒精性肝损伤模型,根据均匀设计U_(17)(17^(16))表,对健脾活血方中8味中药分组实验,取材前3.5 h各组大鼠灌胃等量内毒素脂多糖,测定门静脉血浆内毒素含量作为肠通透性的考察指标。根据均匀设计法进行逐步回归分析,筛选出主效应中药或某种配伍组合。然后,对筛选出的主效应中药或组合再以该模型进行效应验证。结果:回归方程结果提示,健脾活血方中白芍、泽泻、五味子组合且生药剂量分别为1.33、0.50、0.17 g/kg时,抑制肠渗漏的效果最佳。验证实验显示,该"筛选"结果可靠。结论:白芍、泽泻、五味子是健脾活血方改善肠道通透性的主效应中药(组合);应用均匀设计法可有效揭示中药复方针对某一作用环节的主效应中药或组合。

摘要：目的明确扶正化瘀复方抗肝纤维化的作用是否与其抑制自噬有关。方法C57小鼠随机分为正常组(N组)和造模组,造模组采用四氯化碳腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型,正常组注射等剂量橄榄油,1周后将造模组随机分为模型(M)组、雷帕霉素(Rapa)组、雷帕霉素加氯喹(Rapa+CQ)组、雷帕霉素加丹参酚酸B(Rapa+SalB)组、雷帕霉素加扶正化瘀方(Rapa+FZ)组,各药物组每日相应药物灌胃,N组、M组等剂量饮用水灌胃。5周后处死小鼠,HE和天狼猩红染色分别观察各组肝组织炎症和胶原沉积情况,碱水解法测定羟脯氨酸含量。蛋白质印迹法检测肝组织中自噬的表达变化和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3II/I)、p62、α-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白表达,冰冻切片免疫荧光染色观察各组肝组织ɑ-SMA及LC3B免疫荧光定位。两独立样本间的比较用t检验,多个样本均数比较采用LSD检验或DunnettT3检验。结果N组与M组小鼠体质量差异无统计学意义,各药物组小鼠体质量均明显下降(F=14.041,P<0.001)。M组和各药物组小鼠的肝质量/体质量比和脾质量/体质量比较N组均有明显增加(F值分别为26.992、6.589,P值均<0.001)。与M组比较,各用药组小鼠肝组织p62蛋白表达降低,其中Rapa组和Rapa+SalB组差异有统计学意义(F=3.085,P值分别为0.039、0.003),Rapa+SalB组则更低;与M组比较,Rapa组LC3BⅡ的表达显著升高(F=7.514,P=0.01)。免疫荧光染色显示N组小鼠肝脏内未见LC3B与α-SMA共染细胞,M组小鼠肝内见到共染细胞,各药物组小鼠肝内共染细胞明显多于M组,其中Rapa+FZ组的共染细胞较少。与N组相比,M组和各药物组胶原显著增加,各药物组胶原沉积较M组减少,各药物组间差异无统计学意义。与N组(值为77.75±48.79)相比,M组小鼠的肝组织羟脯氨酸明显升高(值为293.48±84.43)(F=3.015,P=0.005),各药物组小鼠肝组织羟脯氨酸含量均较M组减少,但差异无统计学意义(F=0.750,P=0.573)。与N组相比,M组α-SMA和I型胶原蛋白的表达均明显增加(F值分别为27.718、18.893,P值均<0.01)。Rapa组和Rapa+SalB组的α-SMA的表达与M组相似;而Rapa+CQ组和Rapa+FZ组较Rapa组和M组有显著降低(P值均<0.01)。Rapa+CQ组的I型胶原蛋白表达明显高于Rapa组(P=0.017),而Rapa+FZ组的I型胶原蛋白表达则明显低于M组(P=0.013)。结论四氯化碳诱导的肝纤维化模型中,观察到肝星状细胞的自噬;雷帕霉素能促进肝细胞和肝星状细胞的自噬;扶正化瘀方和丹参酚酸B均能对抗雷帕霉素促自噬的作用。

摘要：目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)移植对不同剂量X射线致小鼠肝损伤的干预作用。方法将18只雌性C57BL/6J小鼠随机分为0、2、3 Gy照射组,0、2、3 Gy移植组:照射组作为对照,予等体积培养基注射;移植组小鼠予以不同剂量X射线辐照,并予以BMMSC骨髓内注射;第21天末处死取材。每日记录小鼠体质量变化,全自动血液检测仪检测外周血淋巴细胞、红细胞、血小板、血红蛋白含量变化,苏木精-伊红染色观察小鼠肝组织形态变化,生物化学分析仪检测小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性,微板法检测肝组织还原型谷胱甘肽含量,硫代巴比妥酸法检测肝组织丙二醛含量,羟胺法检测肝组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量,免疫组织化学法检测肝组织F4/80蛋白表达,蛋白免疫印迹法测定肝组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应检测肝组织核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)、白细胞介素(IL)-6、Nrf2 mRNA表达。多组比较采用析因设计方差分析,组间比较采用LSD法进行统计学分析。结果与0 Gy照射组比较,3 Gy照射组小鼠外周血淋巴细胞、红细胞、血小板、血红蛋白含量显著降低(P<0.05),血清ALT和AST活性显著升高(P<0.05);肝组织丙二醛含量、F4/80蛋白表达水平、NLRP3与IL-6 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),肝组织T-SOD与谷胱甘肽含量、Nrf2与HO-1蛋白表达水平、Nrf2 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。与3 Gy照射组比较,3 Gy移植组外周血淋巴细胞、红细胞、血小板、血红蛋白含量显著升高(P<0.05),血清ALT和AST活性显著下降(P<0.05),肝组织丙二醛含量、F4/80蛋白表达水平、NLRP3与IL-6 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),肝组织T-SOD与谷胱甘肽含量、Nrf2与HO-1蛋白表达水平、Nrf2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。结论3 Gy剂量X射线辐照可诱导小鼠形成肝脏氧化损伤,小鼠BMMSC移植可改善X射线辐照诱导的小鼠肝脏氧化损伤,其作用机制可能与调控Nrf2/HO-1通路有关。

摘要：目的基于均匀设计法探索扶正化瘀方(Fuzheng Huayu,FZHY)有效成分组合及配伍效应。方法以扶正化瘀方提取物中含量最高的丹参化合物成分F-01及主要入血桃仁活性成分F-02及五味子成分F-03为研究对象,运用均匀设计法,以肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量和天狼猩红(Sirius red,SR)染色胶原半定量为筛选指标,采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_(4))和胆管结扎(bile duct ligation,BDL)诱导大鼠肝纤维化模型,经回归分析获得"最佳配方",并进行再验证。结果(1)均匀设计方案中的JY5组合可显著降低CCl_(4)和BDL诱导的肝纤维化大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性,提高血清白蛋白(albumin,ALB)含量,降低肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量及胶原面积半定量;其回归方程则提示配方P(F-01(32 mg·kg^(-1))+F-02(0.5 mg·kg^(-1))+F-03(0.5 mg·kg^(-1)))是三者降低CCl_(4)肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量和BDL肝纤维化大鼠肝组织胶原沉积从而发挥抗肝纤维化作用的最佳配比。(2)验证实验表明配方P对CCl_(4)和BDL肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALB及肝组织Hyp含量及胶原面积半定量并无显著改善作用,而JY5的抗肝纤维化作用在CCl_(4)和BDL肝纤维化大鼠实验中均得到再证实。结论(1)F-01(16 mg·kg^(-1))+F-02(0.5 mg·kg^(-1))+F-03(2mg·kg^(-1))组合可显著改善CCl_(4)和BDL大鼠肝纤维化,疗效与FZHY原方相当。(2)均匀设计对量效关系呈非线性的中药复方效应成分的研究可能有其一定局限性。

摘要：目的:在中医理论指导下,对先期所构建的乙型病毒性肝炎(以下简称"乙肝")后肝硬化患者报告结局评价量表(PHBC-PRO)预试表进行条目筛选及考核,为乙肝后肝硬化的中医临床疗效评价提供科学、客观、可量化的工具。方法:基于病证结合研究思路及前期临床流行病学调查结果,建立由64条条目组成的PHBC-PRO量表条目池及预调查表。通过对临床预调查的147例患者量表资料采用条目分布考察法、t检验法、离散趋势法、分辨力系数法、相关分析法、克朗巴赫系数法等方法的分析,对条目进行筛选与优化。结果:设定条目被所选方法中至少4种同时删除为筛选标准,最终形成由57个条目组成、涵盖3个领域(生理、心理及社会)的PHBC-PRO量表,经克朗巴赫系数法检验,提示信度较好(α=0.955)。结论:遵循国际PRO量表研制的原则和方法构建的中医PHBC-PRO量表,符合中医理论及量表规范、具较强的可操作性及适用性,可用于中医对乙肝后肝硬化患者临床证候及疗效的客观评价。

摘要：目的:运用均匀设计方法,从"祛湿化瘀方"中的5个中药组分或成分中筛选出中药组分复方"BZL",并验证其对实验性脂肪肝大鼠的作用疗效。方法:采用高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝模型,将"祛湿化瘀方"中5种有效组分或单体(绿原酸、栀子苷、姜黄素、虎杖苷、白术多糖)作为研究对象,运用均匀设计方法进行分组设计,并且灌胃给药4周,筛选指标为肝组织甘油三酯(TG)含量,通过均匀设计和回归分析而筛选出中药组分复方"BZL"方。再以同样的脂肪肝动物模型,用母方"祛湿化瘀方"和罗格列酮作为对照,测定实验大鼠的肝组织TG含量和血清ALT活性变化,观察其肝组织病理变化(HE染色和油红O染色),并进行Ridit分析,以此来验证其作用疗效。结果:经过筛选,从而得到回归方程:Y=15.083X1+5.321X2-5.186X3-16.157X4+9.35X5+17.667X3X4-8.422X1X2-6.617X3X5+16.571(X1绿原酸、X2虎杖苷、X3白术多糖、X4栀子苷、X5姜黄素),根据此方程,当绿原酸、白术多糖、栀子苷取最大剂量时出现降TG最佳效应,表明对肝组织TG含量抑制作用最佳组分组合为白术多糖(X3)、栀子苷(X4)、绿原酸(X1)组合(即"BZL方");在相同的高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠模型中,筛选出的中药组分BZL均能可显著降低其肝组织TG含量和血清ALT活性(P<0.01),明显改善大鼠肝脏的脂肪变性。结论:通过均匀设计方法筛选出来的中药组分复方"BZL"方有显著防治高脂肪饮食诱导大鼠肝脂肪沉积和损伤的作用。