摘要：目的·构建大鼠Eap1-shRNA慢病毒干扰载体,观察在细胞阻断Eap1基因表达对Kiss1基因表达的影响。方法·针对大鼠Eap1基因mRNA序列设计4条shRNA干扰序列及1条阴性对照序列,序列合成后连接至LV3质粒构建重组慢病毒质粒载体。经鉴定正确后,与包装质粒pGag/Pol、pRev、p VSV-G共同转染293T细胞进行慢病毒包装并测定病毒滴度。将构建好的慢病毒感染NRK-52E细胞,感染72 h后收集细胞,采用real-time PCR及Western blotting技术检测Eap1基因mRNA和蛋白表达水平的变化。筛选出干扰效果最佳的干扰慢病毒再次感染NRK-52E细胞(设置空白对照和阴性对照),感染72 h后检测Kiss1 mRNA表达水平的变化。结果·NRK-52E细胞感染72 h后,阴性对照慢病毒与空白对照组相比,Eap1 mRNA及蛋白的表达量均无明显差异,而各干扰病毒组Eap1 mRNA及蛋白的表达量均显著降低,且以慢病毒Eap1-shRNA4干扰效果最佳。阻断NRK-52E细胞Eap1基因表达后,与对照组相比,其Kiss1 mRNA表达水平明显增高。结论·成功构建大鼠Eap1-shRNA慢病毒表达载体;阻断NRK-52E细胞Eap1基因表达后,Kiss1表达水平下降。

摘要：目的·探讨抑制神经元细胞和雌性大鼠下丘脑弓状核中甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor 1,Ttf1)基因的表达对亲吻素(Kiss1)和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)基因表达的影响。方法·针对大鼠Ttf1基因的mRNA序列分别设计3对特异性的干扰序列(TTF1-shRNA1、TTF1-shRNA2、TTF1-shRNA3),包装成慢病毒质粒。以神经元细胞ND7-23为体外模型,采用real-time PCR及Western blotting技术筛选干扰效率最高的慢病毒质粒(LV-TTF1-shRNA),转染72 h后检测Kiss1和GnRH基因的表达。将LV-TTF1-shRNA和空载质粒注射到21日龄雌性大鼠的下丘脑弓状核内,分别在幼年期(25日龄)、青春发育早期(35日龄)、成年期(42日龄)检测弓状核内Kiss1和GnRH基因的表达变化并观察雌鼠的阴门开放时间。结果·慢病毒质粒转染ND7-23细胞72 h后,LV-TTF1-shRNA2组、LV-TTF1-shRNA3组的Ttf1 mRNA及蛋白表达均显著减少(均P<0.05),其中LV-TTF1-shRNA3干扰效果最佳。采用LV-TTF1-shRNA3抑制ND7-23细胞中Ttf1表达后,Kiss1和GnRH基因的mRNA表达均显著降低(均P<0.05)。雌鼠弓状核内双侧显微注射LV-TTF1-shRNA3后,25日龄、35日龄、42日龄大鼠弓状核Kiss1和GnRH的mRNA均显著降低(均P<0.05),35日龄和42日龄时KISS1蛋白水平明显降低,且雌鼠阴门开放时间延迟。结论·在细胞水平和雌性大鼠弓状核内抑制Ttf1基因表达均使得Kiss1和GnRH基因表达显著下调,也导致雌鼠阴门开放时间明显延迟。

摘要：目的构建大鼠NELL2基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NELL2的microRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应。方法从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的片段克隆至表达载体pcDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2。针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4)。将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组),采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染pcDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组。结果酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确。Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P<0.05或P<0.01)。结论成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒,证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应。

摘要：目的在细胞水平观察microRNA(miRNA)载体瞬时转染293T细胞株后对KiSS1基因转录、翻译的干预效应。方法以SD大鼠基因组DNA为模板,克隆KiSS1基因全长序列,构建重组载体pcDNA3.1(+)-KiSS1。应用miRNA设计软件,针对大鼠KiSS1基因的4个不同靶位点设计4对干扰序列及1对非相关性的阴性对照序列,得到miRNA表达载体p-KiSS1-miRNA1-4及p-KiSS1-miRNA-neg。利用脂质体介导将上述载体与pcDNA3.1(+)-KiSS1共转染293T细胞,采用荧光显微镜及免疫荧光技术检测转染72 h后细胞中各载体表达。采用实时荧光定量-PCR(RT-RCR)及Western blot技术观察转染48 h及72 h后miRNA表达载体对KiSS1基因的干预效应。结果荧光显微镜观察到miRNA载体转染293T细胞后可表达绿色荧光蛋白,免疫荧光结果显示转染pcDNA3.1(+)-KiSS1载体组可见红色的KiSS1蛋白在细胞质中表达;RT-PCR结果显示干预组细胞KiSS1 mRNA表达显著低于阳性对照组和阴性对照组(Pa<0.05)。其中p-KiSS1-miRNA2组KiSS1基因表达抑制最显著,降低了85%;Western blot结果显示p-KiSS1-miRNA2干预组KiSS1蛋白表达明显低于阳性对照组及阴性对照组。结论 4个miRNA载体对大鼠KiSS1基因均具有抑制效应,其中针对KiSS1 mRNA序列304～324 bp的p-KiSS1-miRNA2抑制效果最佳,为个体水平沉默KiSS1防治性早熟的研究提供依据。

摘要：背景:性早熟患儿在下丘脑-垂体-性腺轴提前启动的同时伴有骨骼生长加速,骨骺提前融合,临床上在发病时采用滋阴泻火中药可延缓骨龄提前融合,到性发育年龄时改用益肾填精中药,可促进性发育及促进骨骼生长加速,性早熟患者性发育及骨生长过程与正常青春期发育相同,只是时间的提前。中药改变骨生长的机制及对影响骨生长的生长抑素的作用尚不明确。目的:探讨补肾中药对下丘脑室周核生长抑素的调节作用。设计:完全随机分组设计,对照实验。单位:上海交通大学附属儿童医院内分泌科。材料:实验于2001-10/2002-04在上海复旦大学附属儿科医院儿科研究所完成。采用清洁级纯种雌性SD大白鼠共24只。随机分为4组:对照Ⅰ组,滋阴泻火药组,对照Ⅱ组,滋阴泻火+益肾填精药组,每组6只。方法:①对照Ⅰ组:灌胃生理盐水5mL/次,1次/d,共1个月;滋阴泻火药组:灌胃滋阴泻火中药合剂(生地黄、炙龟板、黄柏、知母等),5mL/次,1次/d,共1个月;对照Ⅱ组:灌胃生理盐水5mL/次,1次/d,共2个月;滋阴泻火+益肾填精药组:先灌胃滋阴泻火中药5mL/次,1次/d,1个月,再喂饲益肾填精中药合剂(熟地黄、龟板胶、仙灵脾、鹿角胶等),5mL/次,1次/d,1个月。②采用漂浮法原位杂交、常规免疫组化技术。以医学图像分析软件,作各组大鼠下丘脑室周核生长抑素mRNA、生长抑素免疫反应阳性神经元计数并检测其阳性细胞面积吸光度(A值)反映其基因表达及蛋白表达的水平。单位面积阳性神经元数即每平方毫米面积中所含阳性神经元数量。③计量资料比较采用单因素方差分析处理,组间差异采用F检验。主要观察指标:滋阴泻火及益肾填精中药对下丘脑室周核生长抑素基因和蛋白表达水平的影响。结果:大鼠24只均进入结果分析。①下丘脑室周核生长抑素mRNA阳性神经元数、单位面积阳性神经元数和阳性细胞面积A值:滋阴泻火药组明显高于对照Ⅰ组(P<0.05),滋阴泻火+益肾填精药组明显低于滋阴泻火药组(P<0.05)。②滋阴泻火药组下丘脑室周核生长抑素阳性神经元数、单位面积阳性神经元数、阳性细胞面积A值:滋阴泻火药组明显高于对照Ⅰ组(P<0.05),滋阴泻火+益肾填精药组明显低于滋阴泻火药组(P<0.05)。结论:滋阴泻火与益肾填精中药可通过对下丘脑生长抑素基因表达与蛋白表达的调控,调节垂体生长激素的合成及释放。