摘要：目的构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化,为抗骨质疏松药物开发提供新平台。方法使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图,利用光刻技术制备浇注母版。以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料,通过模具浇注制备芯片主体。以牛皮质骨片为间隔,分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭。芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组,成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上,成骨诱导14 d,破骨诱导7 d。成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞。观察指标包括:(1)芯片外观及密封性:芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能。(2)生物相容性:MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3 d及培养1、3、5 d后,分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(AM/PI)染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)实验观察细胞存活情况。(3)成骨分化情况:对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情况。收集成骨诱导组和成骨对照组细胞RNA,qPCR检测成骨细胞标志基因Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原(COL1A1)表达情况,观察成骨细胞分化程度和成骨能力。(4)破骨分化情况:对破骨诱导组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞分化情况。提取破骨诱导组和破骨对照组细胞RNA进行破骨分化基因qPCR,检测破骨细胞标志基因TRAP、组织蛋白酶K(CTSK)和树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)表达水平。结果双层含骨基质骨器官芯片大小为3 cm×3 cm,整体透光,芯片系统结构对接紧凑,无渗液。钙黄绿素AM/PI染色结果显示,MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养3 d后,呈红色荧光死细胞极少。CCK-8实验结果显示,MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养5 d内,细胞活力均在90%以上,表明芯片生物相容性好,细胞可以正常存活并增殖。ALP染色和茜素红染色结果显示,成骨诱导14 d,成骨诱导组MC3T3-E1细胞成功分化为成骨细胞并产生钙化结节。qPCR结果显示,成骨诱导组MC3T3-E1细胞的RUNX2相对表达量为4.98±0.74,显著高于对照组的0.99±0.03(P<0.01);MC3T3-E1细胞的OCN相对表达量为7.98±0.76,显著高于对照组的1.00±0.06(P<0.01);MC3T3-E1细胞的COL1A1相对表达量为7.07±0.56,显著高于对照组的0.97±0.03(P<0.01)。TRAP染色结果显示,破骨诱导7 d,破骨诱导组RAW264.7细胞形成巨大的多核破骨细胞,破骨细胞表达大量TRAP蛋白。qPCR检测结果显示,破骨诱导组RAW264.7细胞的TRAP相对表达量为3.35±0.37,显著高于对照组的1.01±0.06(P<0.01);RAW264.7细胞的CTSK相对表达量为3.46±0.79,显著高于对照组的1.01±0.05(P<0.01);RAW264.7细胞的DC-STAMP相对表达量为1.92±0.12,显著高于对照组的0.98±0.08(P<0.01)。结论双层含骨基质骨器官芯片结构紧凑,可长期体外培养,生物相容性好,可进行成骨和破骨细胞分化诱导,有望为骨质疏松机制探究和药物筛选提供新的研究平台。

摘要：目的构建微流控器官芯片,并评估其在模拟骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑的能力。方法基于微流控技术和细胞共培养技术设计芯片主体,MC3T3-E1细胞贴壁培养在细胞接种小室的内部,在细胞接种小室的底部以0.5 ml/min的流速灌流培养基。评价指标:(1)微流控器官芯片的评价:灌流生长培养基,采用模拟仿真实验测试不同时间点细胞接种小室内部和底部液体的浓度差和平衡时间;活死染色观察细胞在设定流速下连续培养3、7 d的生物相容性,分为3 d组和7 d组。(2)微流控器官芯片的促成骨作用:灌流成骨诱导培养基,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和PCR比较细胞在静态和灌流条件下3、7 d的黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因成骨特异性转录因子2(RUNX2)、Ⅰ型胶原(COL1A1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)的表达情况,分为静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组。(3)三种成骨细胞亚型外泌体(EVs)的形态和大小表征及生物相容性:获取三种不同细胞亚型[内皮型成骨细胞(EnOB)-EVs、基质型成骨细胞(StOB)-EVs和矿化型成骨细胞(MinOB)-EVs],通过透射电镜和粒径分析获取形态和大小;灌流含有三种不同细胞亚型EVs的生长培养基,通过细胞增殖/凋亡检测实验比较添加不同EVs浓度(1、1.25、2.5、5μg/ml)24 h的生物相容性,分为EnOB-EVs组、StOB-EVs组、MinOB-EVs组。(4)三种成骨细胞亚型EVs的促成骨作用:灌流含有三种不同细胞亚型EVs的成骨诱导培养基3 d,通过ALP染色和PCR比较黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN的表达情况,分为无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组。结果(1)微流控器官芯片的评价:模拟仿真结果显示,在持续灌流12 h后,上室最上层浓度达到下室浓度的95%以上,最下层为下室浓度的96.5%左右,上下室的浓度差达到平衡状态。活死染色结果表明,芯片在0.5 ml/min的流速下,生物相容性好,灌流3、7 d细胞存活率分别为(99.48±0.12)%、(97.07±1.05)%(P0.05);静态未诱导组COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.03、1.00±0.13、1.00±0.09,静态诱导组分别为9.38±0.25、14.27±4.35、84.01±4.02,灌流诱导组分别为2.39±0.08、133.64±8.87、86.64±8.36(P<0.01)。3、7 d时静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组相互比较,均为灌流诱导组的促成骨能力最强。(3)三种成骨细胞亚型EVs的形态和大小表征及生物相容性:透射电镜下EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs均为典型的茶托状形态。粒径分析结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的大小分别为(91.3±14.7)nm、(106.0±16.0)nm、(68.1±10.7)nm。细胞增殖/凋亡检测结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的最佳给药浓度均为1.25μg/ml。(4)微流控器官芯片对于三种EVs促成骨功能验证:ALP染色结果显示,无EVs组黑色ALP阳性细胞最少,添加EnOB-EVs组其次,StOB-EVs组再者,MinOB-EVs组最多。PCR结果显示,无EVs组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00±0.01、1.00±0.03、1.00±0.02、1.00±0.02,EnOB-EVs组分别为1.95±0.11、6.78±2.04、7.99±0.57、6.93±3.83,StOB-EVs组分别为0.79±0.12、5.68±1.53、12.59±3.15、25.59±0.95,MinOB-EVs组分别为0.68±0.

摘要：3D打印,又称增材制造技术。根据美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials,ASTM)的标准定义,通过计算机控制打印机逐层堆叠材料,然后得到所需三维实体的工艺[1—2]。3D打印技术为医学领域的发展提供新的方法,促进了医学3D打印概念的诞生,目前备受众多学者的关注[3—5];并且,在物理医学和康复领域,3D打印能够为矫形器的制造和设计提供独特的方案,从而解决患者的部分功能障碍。

摘要：目的探讨高迁移率族蛋白A2(HMGA2)在脂肪间充质干细胞(ADSCs)成骨分化进程中的作用及其在骨缺损修复中的应用。方法通过GEO数据库和Rstudio软件,挖掘出在ADSCs“成脂-成骨”分化平衡中的关键节点因子HMGA2,并通过在线蛋白互作网络分析工具String和绘图软件Cytoscape,绘制HMGA2在成骨分化中的互作关系网络,预测其下游作用靶点。设计Hmga2 siRNA并转染小鼠原代脂肪间充质干细胞(mADSCs),诱导其体外成骨分化,在不同时间点(Day 3,Day 7,Day 14)收集样本,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色评估成骨分化能力,并通过RT-qPCR和Western blotting检测成骨特异性标志物Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达。将敲低Hmga2的mADSCs移植至小鼠不可自愈合颅骨缺损处,术后6周通过μCT扫描、骨组织学染色检测成骨标志物,评价骨缺损修复效果。结果GEO数据库分析结果显示HMGA2在ADSCs成脂分化进程中表达上调。蛋白互作网络分析提示在ADSCs成骨分化中,HMGA2的潜在作用靶点包括SMAD7、CDH1、CDH2、SNAI1、SMAD9、IGF2BP3、ALDH1A1。抑制Hmga2后,mADSCs中成骨分化相关标志物RUNX2、OPN和OCN的表达显著上调,且碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成增加(P<0.05)。在小鼠颅骨缺损模型中,敲低Hmga2促进了骨缺损部位的新骨形成(P<0.05)。结论HMGA2是调控ADSCs成骨分化的重要因子,抑制Hmga2能显著促进ADSCs成骨分化,并加速体内骨缺损的修复。

摘要：目的构建基于血管化机制的骨不连类器官芯片,并探讨无菌性骨不连发生机制。方法设计半开放微流控芯片,实现人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSC)、人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL1)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养,建立三维器官芯片体系。设置HFL1与HUVEC不同比例与BMSC共培养,分为对照组(HFL1∶HUVEC=1∶1)、纤维化组(HFL1∶HUVEC=3∶1)与血管化组(HFL1∶HUVEC=1∶3)。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红(alizarin red)染色观察BMSC成骨分化情况,qPCR分析成骨标志基因SP7、RUNX2、ALPL、BGLAP及血管化相关基因KDR、VWF转录情况,Western blot检测成骨标志蛋白RUNX2和ALP表达水平。结果BMSC、HFL1和HUVEC共培养体系中BMSC正常生长且出现明显生物矿化行为,血管内皮细胞能够形成有序血管结构,证实体系构建成功。相较对照组,纤维化组BMSC成骨分化下降趋势不明显,矿化标志基因ALPL和BGLAP相对表达量为0.55±0.19、0.42±0.27,差异均有统计学意义(P<0.05);血管化组基因KDR和VWF下调,相对表达量为0.49±0.17、0.49±0.21,差异均有统计学意义(P<0.05)。相较对照组,血管化组BMSC成骨分化基因SP7、RUNX2、ALPL和BGLAP上调,相对表达量分别为2.91±0.52、3.83±1.87、3.22±1.29和5.21±1.46,差异均有统计学意义(P<0.05);血管化基因KDR、VWF上调,相对表达为8.24±2.84、5.32±1.67,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果表明RUNX2、ALP在血管化组中表达增加,纤维化组中表达减少。结论骨不连类器官芯片能够部分模拟骨不连局部微环境,纤维化可能导致骨形成能力和血管化水平显著下降,是无菌性骨不连发生的潜在重要原因。

摘要：目的:基于儿童膝关节MRI图像建立正常膝关节三维实体模型和球囊完全撑开膝关节的三维有限元模型,采用有限元法分析两种球囊撑开器(分开设计/一体化设计)对膝关节的生物力学影响。方法:使用医学建模软件建立儿童膝关节有限元模型,模拟儿童膝关节镜手术过程。建立两种球囊撑开器模型,对球囊模型施加不同的压力,探究分开设计时3种不同形状球囊和一体化设计时不同短轴尺寸球囊与膝关节软骨相互作用的应力分布情况,获得撑开方式的最优设计。结果:当撑开器与膝关节镜分开设计时,球状球囊对软骨的峰值应力影响较小;当撑开器一体化设计时,短半轴3.0 mm逐渐增大尺寸,环状球囊的应力峰值变化较小且软骨上的应力峰值较小,环状球囊短半轴取3.0 mm是一种较优的尺寸。结论:球囊撑开器可以有效撑开一定的膝关节间隙,撑开器一体化设计相比分开设计在术中对膝关节影响较小。本研究为球囊撑开器中球囊几何结构的设计提供理论依据,提高了半月板手术治疗的安全性。

摘要：生物材料作为移植物已广泛应用于骨组织修复,在应用生物材料时需要考虑材料各个方面的性能,如生物兼容性、力学强度、可塑性等。材料的可降解性也是骨修复材料不得不考虑的方面。既往研究表明,生物材料可以通过物理、化学和生物三种方式进行降解。在材料的生物降解过程中,经细胞途径降解是其中重要的一环。这种降解途径主要是通过巨噬细胞、破骨细胞的生物学行为及其所分泌的生物活性氧、酶、酸性代谢物等作用机制进行。认识细胞作用对生物材料的降解有助于更好地理解细胞的生物学行为,精准设计、制造更合理的骨修复材料,既利于材料植入时的初始稳定,也可以符合材料降解与新骨形成的匹配,促进骨再生和骨修复。

摘要：背景：国内外研究发现在一定力学环境下，体外培养的间充质干细胞其增殖分化等一系列生物学特性会发生相应变化。目的：体外观察5-氮杂胞苷与牵拉应力对大鼠骨髓间充质干细胞向肌细胞分化的调控作用。设计、时间及地点：2006-01／2007-06在上海交通大学生物力学实验室完成的细胞观察实验。材料：清洁级3—4周龄雄性SD大鼠30只用于分离培养骨髓间充质干细胞，1-3d龄SD新生鼠4只用于建立骨骼肌阳性细胞株。化学诱导剂5-氮杂胞苷为Sigma公司产品，牵拉设备FX-4000 Flexercell由美国Flexceu Int公司生产。方法：将传至第4代的骨髓间充质干细胞接种于Flex6孔板。①设立5组行成肌家族因子表达Westem—Blot检测：第1组细胞单纯经10μmol/L5-氮杂胞苷诱导1周；第2—4组细胞以10μmol/L5-氮杂胞苷诱导1周后，在1Hz频率、15％幅度应力条件下分别牵拉12，24，36h；第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照。②设立5组行诱导剂及牵拉应力作用的RT—PCR检测：第1组细胞给予1Hz频率、15％幅度应力牵拉24h；第2、3组分别经10μmol/L5-氮杂胞苷诱导1，2周；第4组细胞经10μmol/L5-氮杂胞苷诱导2周后，给与同等应力牵拉24h；第5组以新生鼠骨骼肌细胞作为阳性对照。主要观察指标：不同诱导条件及应力牵拉状态下骨髓间充质干细胞成肌家族因子的表达。结果：①第1组表达成肌因子MyoD与Myf5，成熟肌细胞标志MHC表达不显著；第2—4组MyoD与Myf5的表达明显增强（P〈0．05），且随牵拉时间延长因子的表达逐步增强，MHC表达不显著。②第1组不表达成肌家族因子；第2组表达MvoD、Myf5，第3组表达MyoD、Myf5、desmin，第4组几乎表达所有检测的肌细胞特异性标记。结论：经5氮杂胞苷诱导可启动骨髓间充质干细胞向肌细胞分化，单独的牵拉应力不能诱导成肌。牵拉应力可调控5氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞的诱导分化进程，并且与牵拉作用时间成正性相关。

摘要：目的探讨足部严重创伤采用显微外科技术修复与重建的方法和临床疗效。方法选择2008年11月至2019年10月上海交通大学医学院附属新华医院(崇明)和温州医科大学附属浙江省台州医院收治的足部严重创伤患者, 均采用显微外科吻合技术急诊原位回植修复+二期显微外科组织移植技术精准重建, 恢复足部功能和外形。根据足部损伤部位、范围、平面、程度等特点进行评估, 设计手术方案, 急诊在显微镜下进行患足有效清创和残余组织原位回植修复。根据患足一期组织回植成活情况, 二期采用显微外科组织移植技术精准修复缺损与功能重建。术后定期随访, 根据术后足部皮肤成活情况、色泽弹性、外观形态、供区瘢痕、皮肤感觉、感染控制、患者认可度指标进行疗效评价, 按照皮瓣肿胀4级判断标准进行足部肿胀程度评价;根据足部损伤术后疼痛程度、关节屈伸范围、畸形程度和行走能力进行足部活动功能评价。结果共选择足部严重创伤患者23例, 男15例, 女8例, 年龄17~69岁, 平均38.5岁;左足10例, 右足13例。23例中一期原位回植修复成活15例;足底内侧部分皮肤坏死给予二期植皮处理2例, 皮瓣移植修复足跟部分皮肤坏死1例, 前足底皮肤坏死伴感染2例, 皮瓣或骨皮瓣移植修复足背皮肤坏死感染合并骨缺损3例。术后23例获6~48个月随访, 平均18.5个月, 创面完全愈合, 皮肤色泽、弹性与周围正常皮肤接近, 足部无明显臃肿畸形, 足底感觉功能恢复均为S3~S4级, 瘢痕较小, 行走自由, 无明显跛行。术后疗效评价:满意16例, 一般7例;足部肿胀程度评价:早期为Ⅰ度3例, Ⅱ度10例, Ⅲ度8例, Ⅳ度2例;后期为Ⅰ度15例, Ⅱ度6例, Ⅲ度2例。活动功能评价:优3例、良13例、中7例, 优良率约为69.6%(16/23)。结论采用显微外科技术进行足部严重创伤的修复与重建, 恢复足部功能与外形, 疗效可靠, 患者满意, 是目前治疗足部严重创伤的有效方法之一。

摘要：目的 报道（足母）趾胫侧底动脉蒂足内侧缘静脉营养血管皮瓣的临床应用效果.方法 根据跨趾胫侧底动脉与足内侧缘静脉营养血管间吻合关系,以第1跖趾关节近端（2.2±0.7） cm 处的（足母）趾胫侧底动脉穿出点为旋转点,以旋转点与内踝尖之间足内侧缘静脉走向为轴心线,设计（足母）趾胫侧底动脉蒂足内侧缘静脉营养血管皮瓣,转位修复（足母）趾皮肤软组织缺损.结果 临床应用共5例,皮瓣均成活,创面一期愈合,经1～12个月随访,皮瓣质地优良、色泽接近正常,外形美观.结论 （足母）趾胫侧底动脉蒂足内侧缘静脉营养血管皮瓣可转位修复跨趾皮肤软组织缺损.