摘要：目的 :分别构建人透明带蛋白(zona pellucida, ZP)基因ZP1、ZP2、ZP3、ZP4与荧光蛋白基因的融合蛋白表达载体,并在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞和卵母细胞中表达这些荧光标记的重组融合蛋白。方法:设计合适的PCR引物,采用GeneArt Gibson Assembly克隆技术,将荧光蛋白基因与人透明带基因形成融合基因片段,用特定的双酶分别酶切中间载体pENTR1A(no ccdB)和融合基因片段后,用T4 DNA连接酶将融合基因片段连入中间载体,再通过Gateway克隆技术将中间载体上的融合基因转入表达载体pInducer20,并对产物进行DNA测序。验证融合基因构建成功后,将含透明带融合基因的质粒进行转化,筛选阳性克隆并扩增、抽提质粒。用脂质体转染法将含融合基因的表达载体转染入CHO细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测透明带融合基因mRNA的表达,用蛋白印迹法检测透明带融合蛋白的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察透明带融合蛋白在CHO细胞内的表达及分布。结果:成功构建所需载体并转染CHO细胞;经RTPCR检测证实人透明带ZP1、ZP2、ZP3、ZP4 mRNA在CHO细胞中表达;经蛋白印迹法检测证实CHO细胞中有重组融合蛋白质的表达;在激光共聚焦显微镜下观察到重组融合蛋白在CHO细胞内表达和定位。结论:本研究成功构建了人类透明带4个基因的荧光融合蛋白表达质粒,以此为实验工具,今后可用于诊断卵子异常导致不孕的病因机制研究。