摘要：目的 :分别构建人透明带蛋白(zona pellucida, ZP)基因ZP1、ZP2、ZP3、ZP4与荧光蛋白基因的融合蛋白表达载体,并在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞和卵母细胞中表达这些荧光标记的重组融合蛋白。方法:设计合适的PCR引物,采用GeneArt Gibson Assembly克隆技术,将荧光蛋白基因与人透明带基因形成融合基因片段,用特定的双酶分别酶切中间载体pENTR1A(no ccdB)和融合基因片段后,用T4 DNA连接酶将融合基因片段连入中间载体,再通过Gateway克隆技术将中间载体上的融合基因转入表达载体pInducer20,并对产物进行DNA测序。验证融合基因构建成功后,将含透明带融合基因的质粒进行转化,筛选阳性克隆并扩增、抽提质粒。用脂质体转染法将含融合基因的表达载体转染入CHO细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测透明带融合基因mRNA的表达,用蛋白印迹法检测透明带融合蛋白的表达,并在激光共聚焦显微镜下观察透明带融合蛋白在CHO细胞内的表达及分布。结果:成功构建所需载体并转染CHO细胞;经RTPCR检测证实人透明带ZP1、ZP2、ZP3、ZP4 mRNA在CHO细胞中表达;经蛋白印迹法检测证实CHO细胞中有重组融合蛋白质的表达;在激光共聚焦显微镜下观察到重组融合蛋白在CHO细胞内表达和定位。结论:本研究成功构建了人类透明带4个基因的荧光融合蛋白表达质粒,以此为实验工具,今后可用于诊断卵子异常导致不孕的病因机制研究。

摘要：1.统计学符号:按GB/T3358.1-2009《统计学词汇及符号》的有关规定,统计学符号一律采用斜体。2.研究设计:应告知研究设计的名称和主要方法。如调查设计(分为前瞻性、回顾性还是横断面调查研究),实验设计(应告知具体的设计类型,如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等),临床试验设计(应告知属于第几期临床试验,采用了何种盲法措施等);主要做法应围绕4个基本原则(重复、随机、对照、均衡)概要说明,尤其要告知如何控制重要非试验因素的干扰和影响。