摘要：目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系。方法 使用ClustalX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9 mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系。结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源。在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系。结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础。

摘要：目的通过分析93例携带PRRT2基因c.649dupC突变的发作性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kine⁃sigenic dyskinesia,PKD)患者的临床特点,总结该基因型的临床表型特征。方法收集93例携带PRRT2基因热点突变(c.649dupC)的原发性PKD患者临床资料,采用自行设计的发作性运动诱发性运动障碍登记表记录并整理,就其临床表型进行总结分析,并比较男性与女性以及家族性与散发性患者的临床表型差异。结果93例携带PRRT2基因热点突变的PKD患者男女比例为2.72∶1,平均发病年龄为(9.93±3.52)岁,平均就诊年龄为(23.98±8.92)岁;单纯型54例(58.06%)、复杂型39例(41.94%);87例(93.55%)发作前有预感;发作形式包括肌张力障碍44例(47.31%),舞蹈样动作5例(5.38%),或混合发作(47.31%)。散发性58例(62.37%)、家族性35例(37.63%),外显率为67.05%。62例(66.67%)服用抗癫药物患者中46例(74.19%)症状完全控制,14例(22.58%)发作频率下降但偶有发作,2例(3.23%)未见明显缓解。男性组面部累及比例低于女性组(P=0.017),家族性组面部累及比例低于散发性组(P=0.011)。结论PRRT2基因c.649dupC突变具有基因型-表型异质性,该基因型更容易表现为复杂型PKD,具有外显不全的遗传特点。

摘要：2例患者均幼年起病,主要临床表现为视觉障碍(如视觉闪光点)、偏侧肢体无力、麻木,症状持续约30 min后出现单侧搏动性头痛伴有恶心、呕吐,以上症状在休息后可缓解,不伴其他神经系统疾病。神经系统查体、头颅CT、磁共振成像、脑电图检查和遗传代谢疾病筛查均未见异常。根据《国际头痛疾病分类(第三版)》诊断标准,2例患者符合典型单纯偏瘫型偏头痛的诊断。ATP1A2基因检测显示,2例患者均存在ATP1A2基因突变。病例1为杂合突变c.G2284A/p.G762S,该突变此前报道为致病性突变;病例2为杂合突变c.C3022T/p.R1008W,查阅既往文献及数据库未见该位点单独致病的相关报道。根据美国医学遗传学和基因组学会指南,病例1的ATP1A2基因杂合突变c.G2284A/p.G762S评定为“可能致病”,病例2的ATP1A2基因杂合突变c.C3022T/p.R1008W评定为“意义不明确”。

摘要：目的·调查不同年龄2型糖尿病人群的牙周整体健康水平,探讨年龄对糖尿病患者牙周炎患病率的影响及相关危险因素。方法·对2018年11月—2018年12月至上海交通大学附属第六人民医院内分泌科就诊的2型糖尿病患者进行牙周检查及问卷调查。对指数牙的相关牙周指标进行检查和计分,检查指标包括探诊深度、探诊出血、临床附着丧失(clinical attachment loss,CAL)、牙石指数(calculus index,CI)和菌斑指数(plaque index,PLI)。依据牙周炎的诊断标准,将调查对象分为牙周炎组和非牙周炎组。比较不同年龄段2型糖尿病患者牙周炎的患病率及相关牙周指标的差异。结果·完成调查的916名2型糖尿病患者中,牙周炎组和非牙周炎组患者之间年龄的差异有统计学意义(χ^(2)=100.1,P=0.001)。多因素Logistic回归分析提示,年龄是糖尿病牙周炎的高危因素(P=0.001,OR=2.13,95%CI 1.79~2.55)。相对于年龄较小的患者,高龄糖尿病患者更容易出现牙龈出血(χ^(2)=36.4,P=0.001)、牙齿松动(χ^(2)=25.9,P=0.002)、咀嚼无力(χ^(2)=12.3,P=0.006)等牙周炎症状。不同年龄人群PLI(χ^(2)=8.3,P=0.041)、CI(χ^(2)=12.8,P=0.005)和CAL(χ^(2)=32.5,P=0.001)的差异有统计学意义。在注意刷牙(χ^(2)=18.8,P=0.001)、清水漱口(χ^(2)=21.8,P=0.001)、刷牙频率(χ^(2)=24.0,P=0.001)等多项口腔保健措施上的差异有统计学意义。结论·糖尿病患者的年龄是影响牙周炎患病率和严重程度的危险因素,需要关注高龄糖尿病患者的牙周健康状况,并对该人群开展具有针对性的口腔预防保健工作。

摘要：目的:血管内皮生长因子能促进血管内皮细胞增生和血管形成,而RNA干扰技术可高效特异地导致转录后基因沉默现象。实验针对人血管内皮生长因子基因化学合成小分子干扰RNA,观察其对胶质瘤U251细胞的体外干扰效应。方法:实验于2006-09/2007-02在中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室完成。①实验材料:人类U251胶质母细胞瘤细胞株由上海市肿瘤研究所朱景德教授惠赠。非特异性小分子干扰RNA,绿色荧光标记的FAMnegativecontrolsiRNA(上海吉玛公司)。②实验方法:选择基因序列号为NM0033761的血管内皮生长因子基因cDNA序列上的3个位点设计3条不同序列的小分子干扰RNA,并应用BLAST技术排除其他同源基因。采用脂质体法转染U251细胞,以200nmol/L进行转染,以转染非特异性小分子干扰RNA作为阴性对照组,以未加入小分子干扰RNA作为空白对照组。48h后RT-PCR筛选最佳小分子干扰RNA,将抑制率最高的小分子干扰RNA再分别按50,100,200,300nmol/L进行转染。③实验评估:荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR法半定量检测浓度梯度下小分子干扰RNA对U251细胞血管内皮生长因子mRNA表达的抑制效果。结果:①荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率:镜下可见胞质内的绿色荧光,同一视野下细胞核呈蓝染,转染效率达95%以上。②RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达水平:不同序列的小分子干扰RNA以200nmol/L转染细胞后血管内皮生长因子mRNA的表达水平均有所下调,以小分子干扰RNA1转染组最为明显(P<0.01),抑制率大于70%,选为最佳特异性小分子干扰RNA。U251细胞转染50,100,200,300nmol/L的小分子干扰RNA148h后,随着转染浓度的升高,小分子干扰RNA1的抑制效果逐渐增强,各浓度转染组血管内皮生长因子mRNA的表达水平可下调16%～73%。结论:以血管内皮生长因子为靶基因、化学修饰合成的特异性小分子干扰RNA,在体外可有效抑制目的基因mRNA的表达。

摘要：目的构建抑制自噬基因Beclin 1 shRNA慢病毒载体,建立Beclin 1基因稳定干扰的N2a细胞株,探讨抑制Beclin 1对N2a细胞增殖的影响。方法根据小鼠Beclin 1基因mRNA序列,设计4个Beclin 1靶点并构建shRNA慢病毒质粒。构建好的Beclin 1 shRNA质粒与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293FT细胞后得到病毒颗粒,将产生的病毒颗粒感染N2a细胞。通过荧光定量PCR和Western blot检测感染的N2a细胞中自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达水平,比较shRNA的干扰效率。利用CCK8法检测干扰Beclin 1表达对N2a细胞增殖的影响。结果成功构建了表达Beclin 1 shRNA的慢病毒载体。在稳定感染Beclin 1 shRNA慢病毒载体的N2a细胞中,Beclin 1表达显著降低。抑制Beclin 1表达有促进N2a细胞增殖的趋势,但差异无统计学意义。结论成功构建了自噬基因Beclin 1 shRNA慢病毒表达载体,可显著抑制N2a细胞中Beclin 1表达。抑制Beclin 1表达有可能促进N2a细胞的增殖。