摘要：鉴定分离到的微需氧菌为螺旋杆菌 ,并对该菌进行分型。小鼠皮下或肌肉注射地塞米松使其免疫抑制 ,取小鼠肠内容物培养 ,对分离到的细菌 ,经油镜、电镜观察。然后提取细菌DNA ,用根据螺旋杆菌 (Helicobactersp .)rRNA保守区设计的引物P7 P8进行扩增 ,并对扩增产物分别用MboI、HhaI、XspI内切酶酶切 ,酶切产物用 1 0 %PAGE分析。再用根据螺旋杆菌胆型 (H .bilis)rRNA设计特异引物P7 Pb扩增 ,将扩增产物测序分析。最后 ,将该细菌在Scid小鼠上作动物感染。细菌在油镜下呈鸟翼状 ,电镜下观察到双极鞭毛 ,无周质纤毛。引物P7 P8扩增出 374bp的特异带 ,此片段能分别被MboI、HhaI、Xsp内切酶酶切。引物P7 Pb扩增出364bp的条带 ,测得的DNA序列中存在MboI、HhaI、XspI的内切位点 ,与文献中H .bilis序列比较 ,同源性为 97 5 %。动物感染试验符合Koch准则。

摘要：根据生物素与链霉亲和素的亲和原理,利用磁珠富集法筛选东方田鼠(Microtus fortis)微卫星分子标记。链霉亲和素磁珠捕获生物素标记的微卫星探针,然后与连有接头的单链限制性酶切片段复性结合,获得含有微卫星的单链片段,PCR扩增形成双链,连接T载体并转化感受态细胞,得到东方田鼠微卫星富集文库。随机挑选70个阳性克隆,经测序分析,获得微卫星序列92个。设计合成27对微卫星引物并成功筛选出21对可用引物,取其中10对引物,荧光标记后对3个人工驯养及野生东方田鼠种群进行遗传多样性分析。结果显示,文章所构建的东方田鼠微卫星文库的阳性克隆率较高,初步筛选的10个微卫星标记均为具有高度多态性的微卫星标记。在3个东方田鼠种群中,野生湖南种群的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)均最高,人工驯养的湖南种群次之,人工驯养的宁夏种群最低。

摘要：本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,***）、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,***）的三重PCR检测方法。根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验。结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368bp。最佳退火温度在56~59℃之间,引物浓度均为0.2μmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Mg2＋浓度为2.5mmol/L。3种细菌间无交叉反应。对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应。最低能同时检测到10-5 ng/μL的细菌基因组DNA。3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好。同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出。结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持。

摘要：用小鼠肝炎病毒的MHV1、MHV3、A59、JHM四株分别感染DBT细胞 ,收获病毒 ,提取病毒RNA。依据小鼠肝炎病毒的病毒基因、M结构蛋白、mRNA的基因保守区分别设计出多对引物 ,按各对引物的条件建立了RT -PCR方法 ,比较了不同引物敏感性和特异性 ,并比较选择与MHV同为冠状病毒的传染性支气管炎 (IBV)标准株和野毒株没有交叉的最佳特异引物。敏感性实验检测到 1 0pg的小鼠肝炎病毒RNA。

摘要：目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus)F蛋白主要抗原片段FP(S),并对表达产物进行免疫学初步研究。方法根据GenBank公布的仙台病毒F蛋白(gi:9627219)的基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR扩增出F基因的主要抗原片段FP(S),插入pMD-18-T载体中,鉴定正确后克隆入pQE31原核表达载体中,将鉴定正确的pQE31-FP(S)转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导表达,对大肠埃希菌裂解物进行SDS-PAGE和Western-blot验证。结果大肠埃希菌表达的FP(S)相对分子质量约26×103,与预期相符;能与SeV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的FP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测仙台病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。

摘要：为建立快速检测啮齿柠檬酸杆菌(***)esp B基因的方法,本研究根据Gen Bank中登录的*** esp B基因序列设计1对特异性引物,建立了*** SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,在102拷贝/μL^108拷贝/μL浓度范围内标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法仅对***进行特异性扩增,而对牛棒状杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。其检测灵敏度可达24拷贝/μL。组内和组间试验变异系数均小于1%,重复性良好。临床样品初步应用结果显示,荧光定量PCR阳性检出率为56.36%(31/55),常规PCR阳性检出率为30.91%(17/55),二者符合率为74.55%。本研究建立的*** SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为实验动物***的检测和流行病学调查提供了技术支撑。

摘要：目的对小鼠肝炎病毒(mouse hapetitis virus)A59毒株核蛋白(N)基因进行了克隆、表达和重组蛋白的免疫活性分析。方法根据GenBank公布的MHV-A59 N基因序列(AY700211),设计了一对特异性引物,通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS,将目的片段纯化后与pGEM-T-easy载体连接得到重组质粒pTN,双酶切回收目的基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pGEX-NS,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行了诱导表达。对表达裂解物进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表达产物相对分子质量约56×103与预期相符;能与MHV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的NP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测小鼠肝炎病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。

摘要：目的建立犬细小病毒的核酸诊断方法(PCR方法)并应用于临床诊断。方法根据犬细小病毒VP2基因序列设计引物,以犬细小病毒标准株、犬传染性肝炎病毒和正常增殖细胞DNA为模板,犬细小病毒扩增出221bp的特异带,将PCR产物连接到pMD18_T Vecter,转化大肠杆菌JM109菌株。重组质粒经测序并经blast比较,与GenBank中已登录的犬细小病毒VP2基因序列进行比较。同时将建立的PCR方法应用于30份犬粪便和病犬组织的检测,并测序。结果PCR产物测得的序列与GenBank的基因序列同源性为100%,粪便检测均无犬细小病毒的特异带,从病犬组织中有6份样品扩增出221bp的特异带,经测序比较,同源率为100%。结论建立了犬细小病毒的PCR检测方法,并能应用于临床诊断。

摘要：根据弓形虫 P30基因序列设计二对引物分别进行了 PCR一次扩增和套式扩增 ,结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段 91 4bp、5 2 2 bp和 5 2 2 bp;套式扩增出现的条带比一次扩增出现的条带亮度明显增强。提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性。用外引物进行扩增后 ,最低可以检测到 1 pg的弓形虫 DNA。说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。用内引物对人工感染弓形虫的 ICR小鼠血液、组织进行弓形虫 DNA的检测 ,结果均扩增出 5 2 2 bp的扩增带。根据 B1基因序列设计的引物进行 PCR一次扩增和半套式扩增。结果均出现预期的扩增片段 61 9bp、362 bp和 362 bp;用半套式扩增检测感染弓形虫的 ICR小鼠血液、组织时可扩增出5 2 2 bp的扩增带 ,半套式扩增比一次扩增更敏感。

摘要：根据泰泽氏菌 r DNA序列设计出二对特异引物 ,以标准菌 RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的 DNA为模板 ,进行套式 PCR反应。结果用外引物扩增 ,泰泽氏菌和大肠杆菌均出现 62 5 bp的反应带 ,其它细菌无反应带 ;而用内引物第二次扩增 ,只有泰泽氏菌出现 1 96bp的特异扩增带。将 PCR方法应用于人工免疫抑制的 SD大鼠 ,检出率为 3 0 % ( 9/ 3 0 ) ,同时将此 3 0份血清用间接免疫荧光法 ( IFA)进行检测 ,结果未检出阳性样品。结果提示 ,套式 PCR方法具有特异性强、敏感性高 ,简便快速的特点。