摘要：扩增噬菌体人基因组文库以形成多个亚文库并富集稀有目的克隆。利用人免疫球蛋白Cγ基因启动子、编码区设计的多对探针引物,PCR筛选已扩增的亚文库,获得共阳性亚文库;利用多条同位素标记的探针筛选上述共阳性亚文库,经相应探针引物PCR鉴定,获得共阳性多克隆噬菌斑;2000倍稀释共阳性多克隆噬菌斑稀释液,PCR筛选出阳性单克隆噬菌斑。基因转换到pBSK(+)载体测序,筛到长12 kb的人免疫球蛋白重链Cγ基因,含有启动子、编码外显子、穿膜外显子及polyA序列。与传统的单条探针筛库相比,新策略利用多条探针一次同位素标记,就筛到完整的稀有Cγ基因;利用PCR在亚文库、多克隆噬菌斑稀释液、单克隆噬菌斑稀释液三个层面上筛选,逐步缩减的筛选范围是一次同位素标记筛到完整稀有基因的前提。新策略不仅提高一倍工作效率,降低几倍的耗材,同时为需要长片段基因的功能基因组领域提供筛选捷径。

摘要：根据已知的cDNA序列设计引物 ,通过RT PCR获得小鼠bcl10基因cDNA片段作为探针 ,用噬斑原位杂交法克隆 12 9品系小鼠的bcl10基因组DNA ,在亚克隆完成序列结构分析的基础上 ,利用常规分子克隆技术 ,构建完成了针对bcl10基因的替代型基因敲除载体。两条同源臂分别为bcl10基因exon3上游 2 .4kb和exon4下游 4 .5kb的基因片段。构建完成替代型小鼠bcl10基因敲除载体 ,为后续获得bcl10基因缺陷型胚胎干细胞系奠定了实验基础。