摘要：目的建立基于细胞感染的实时定量逆转录PCR(real time quantitative reverse-transcription PCR, RT-qPCR)法, 用于水痘减毒活疫苗感染性病毒滴度检测。方法根据水痘减毒活疫苗毒种V-Oka株的基因序列设计特异性引物及探针。将参考品及待测样品系列稀释后接种MRC-5细胞, 经培养后收获细胞, 提取RNA, 进行一步法RT-qPCR检测, 通过平行线法计算样品滴度, 并将检测结果与中国药典2020年版三部规定的空斑法进行对比。结果感染细胞适宜收获时间为36~48 h, 可检测样品滴度范围为2.8~5.0 lgPFU/ml。与空斑法检测的滴度之间的差异无统计学意义(冻干疫苗组t=1.09, 疫苗原液组t=0.59, P值均>0.05)。结论初步建立了基于细胞感染的RT-qPCR法, 可用于水痘减毒活疫苗病毒滴度检测。

摘要：目的建立皮内注射用卡介苗(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)特异性鉴别试验的多重PCR法,并进行验证。方法根据GenBank登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590. 1)设计并合成引物,以制备的BCG特异性鉴别试验国家参考品(简称BCG鉴别参考品)DNA为模板,多重PCR法扩增其特异性缺失区RD1,产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,验证方法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度;采用该方法检测8批皮内注射用BCG供试品。结果 BCG鉴别参考品在重复检测6次、2名检测人员分别重复检测3 d、不同PCR退火温度及不同DNA聚合酶加量时均扩增出约200 bp的核酸片段;最低可检10 pg/mL的目的基因,仅对结核分枝杆菌H37Rv及皮内注射用BCG样品DNA扩增出特异性条带。经该方法检测,8批供试品PCR产物电泳均可见单一的目的条带,无RD1序列存在,大小与BCG鉴别参考品一致。结论多重PCR法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度良好,可应用于皮内注射用BCG特异性鉴别试验。