摘要：为了建立以及应用鸡细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的实时荧光定量PCR方法,以鸡Skp2基因为研究对象,根据GenBank中已发表的鸡Skp2和β-actin序列的高度保守区域设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中Skp2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,并对其Tm值和引物浓度等进行了优化。该方法最优反应体系为20.0μL,包含Real-time PCRMaster mix(2×)10.0μL,上、下游引物(10.0μmol/L)各1.0μL,cDNA 2.0μL,ddH2O 6.0μL;最佳反应条件为95℃预变性10 s,95℃变性5 s,60℃退火/延伸34 s,30个循环。应用该方法对CEF中Skp2 mRNA的表达量进行检测,发现在CEF感染禽网状内皮组织增生病病毒(REV)后,其细胞中Skp2 mRNA表达量均高于对照组,且在24、48、72 h显著增加。研究首次建立了检测鸡Skp2基因的检测方法,该方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步定量研究鸡Skp2 mRNA表达及其与细胞周期的关系奠定了基础。