摘要：为研究旋毛虫谷氨酸脱羧酶(GAD)基因在其谷氨酸依赖型抗酸系统2(AR2)中的作用,本研究根据GenBank中登录的旋毛虫GAD基因序列,设计3条靶向该基因的siRNA(GAD-siRNA1~GAD-siRNA3)及一条阴性对照NC siRNA。将这4条siRNA以2μmol/L的剂量通过浸染法分别转染旋毛虫肌幼虫(后均简写为肌幼虫),12 h后分别采用荧光定量PCR和western blot检测各siRNA的干扰效果;采用不同剂量的最佳siRNA按照上述方法转染确定最佳干扰剂量。结果显示,2μmol/L的GAD-siRNA1(后简写为siRNA1)对GAD基因的干扰效果最好。将2μmol/L siRNA1、NC siRNA分别在不同pH值的培养液中利用浸染法分别转染肌幼虫,培养不同时间后分别计算各组存活率;同时利用荧光定量PCR方法检测GAD基因的转录水平;采用比色法建立γ-氨基丁酸(GABA)的标准曲线,通过酶活性公式和标准曲线计算酸环境培养0.5 h后各组培养液中GAD的酶活性并测定其pH值。存活率结果显示,随培养时间的增加,同一pH值培养液中各组肌幼虫的存活率均降低,其中siRNA1组肌幼虫的存活率明显低于PBS和NC siRNA组(NC组)(P<0.05),其在pH2.5培养0.5 h时的存活率最低,各组肌幼虫在pH6.6培养0.5 h时的存活率均最高。荧光定量PCR结果显示,相同p H条件下,随培养时间的延长,siRNA1组肌幼虫GAD基因的转录水平均显著低于PBS和NC组。相同培养时间内,与两个对照组相比,随着培养液p H值的减小,siRNA1组肌幼虫GAD基因的转录水平均增加,且该组肌幼虫在pH2.5时GAD基因的转录水平显著高于pH6.6时的转录水平(P<0.05)。上述结果表明,酸性环境可以诱导旋毛虫肌幼虫GAD基因转录水平的升高。酶活性测定结果显示,相同pH条件下,siRNA1组肌幼虫培养液中GAD的酶活性均比PBS组和NC组低,且该组肌幼虫在pH2.5和pH4.0时GAD的酶活性显著高于pH6.6和pH8.0(P<0.05);p H值测定结果显示,siRNA1组肌幼虫培养液pH值相比其在不同pH条件下培养前均略升高,但差异不显著。上述结果表明,干扰GAD基因后会降低旋毛虫肌幼虫GAD的酶活性,且在酸性条件下该酶活性较高。将GAD基因干扰后的肌幼虫感染小鼠,感染后第7 d迫杀小鼠收集成虫,计算旋毛虫成虫减虫率,感染后42 d采用相同方法计算肌幼虫的减虫率、繁殖力指数(RCI)及每克肌幼虫数(LPG);采集各组小鼠的膈肌,制作病理切片并经显微镜观察肌幼虫的保姆细胞。结果显示,siRNA1组成虫减虫率为31.50%,肌幼虫的减虫率为49.15%,RCI为62.51±7.32,LPG为1250.22±146.48。PBS组和NC组肌幼虫的RCI、LPG则显著高于siRNA1组(P<0.05);小鼠膈肌病理切片观察可见,siRNA1组肌幼虫子代保姆细胞壁周围有大量炎性细胞,且保姆细胞裂解,而两个对照组肌幼虫子代保姆细胞壁周围无炎性细胞。表明干扰GAD基因后肌幼虫体内的抗酸能力降低,对宿主免疫系统的抵抗力减弱。本研究首次证实了旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制在其抵抗酸环境过程中发挥的作用,为旋毛虫抗酸系统的全面研究奠定了基础,并为旋毛虫病的预防提供了新思路。

摘要：为了建立快速检测猪旋毛虫病的血清学方法,分别用旋毛虫GAD、GLS重组蛋白作为包被抗原,建立2种检测旋毛虫血清抗体的间接ELISA方法。对抗原包被条件、血清稀释度、封闭液的选择与封闭时间、酶标二抗的稀释度与孵育时间和TM B作用时间等条件进行了优化。旋毛虫GAD包被抗原间接ELISA方法和GLS包被抗原间接ELISA方法的阴阳性临界值分别为0.848和0.963;这2种间接ELISA方法批内和批间重复试验的最大变异系数均小于10%,且用这2种方法分别对猪蛔虫阳性血清、华支睾吸虫阳性血清和弓形虫阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明这2种方法具有很好的稳定性和特异性。同时用这2种间接ELISA方法和旋毛虫抗体快速检测卡分别对感染旋毛虫不同数量、不同时间的小鼠血清进行检测,结果显示,这2种间接ELISA方法具有较高的敏感性。本研究中建立的这2种间接ELISA方法为旋毛虫病的早期诊断和流行病学调查提供了必要的手段。

摘要：为探究旋毛虫肌幼虫中是否存在谷氨酰胺依赖性抗酸机制(AR4),本研究根据GenBank中旋毛虫肌幼虫谷氨酰胺酶(TsGLS)基因序列设计3条特异性siRNA分子,并通过浸泡法分别导入旋毛虫肌幼虫体内,利用荧光定量PCR(qPCR)、western blot以及间接免疫荧光试验(IFA),筛选沉默效果最佳的siRNA分子,并确定其最佳转染条件,结果显示,siRNA-881为基因沉默最佳的siRNA分子,且转染12 h、2μmol/L浓度、培养3 d为最佳基因沉默条件。在不同的酸性条件下培养并检测转染siRNA后旋毛虫肌幼虫的存活率,进一步将转染siRNA-881的旋毛虫肌幼虫接种小鼠,分析TsGLS基因沉默对减虫率、保姆细胞壁厚度及子代肌幼虫基因转录水平的影响。转染siRNA-881后旋毛虫肌幼虫的存活率结果显示,在pH 2.5培养2 h时的存活率明显低于其他酸性环境下;转染siRNA-881的旋毛虫肌幼虫接种小鼠后7 d旋毛虫成虫减虫率和35 d旋毛虫肌幼虫减虫率分别为61.64%和66.71%;将保姆细胞壁厚度与PBS对照组比较,siRNA-881组(15.90±1.301)保姆细胞壁厚度降低了39.78%;siRNA-881转染旋毛虫肌幼虫后,子一代肌幼虫TsGLS基因的转录水平较亲代相比降低30.30%。以上结果表明,旋毛虫具有类似于大肠杆菌中存在的谷氨酰胺依赖性抗酸系统(AR4),抑制旋毛虫TsGLS基因表达可明显降低旋毛虫肌幼虫抗酸能力。本研究首次证实通过RNA干扰技术可有效抑制旋毛虫肌幼虫TsGLS基因的表达,使该虫的抗酸能力减弱,且在宿主肠道的定植能力下降,该结果为研究旋毛虫的致病机制及其感染的防治提供新思路。

摘要：旨在探究旋毛虫肌幼虫体内是否存在鸟氨酸依赖型抗酸系统,本研究根据GenBank中Ts-ODC全序列基因组设计三条特异性siRNA分子,采用脂质体浸染转染的方法将其分别转染至旋毛虫肌幼虫体内,使用qPCR、Western blot和间接免疫荧光试验,筛选最佳干扰siRNA分子及最佳干扰条件;并在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的条件下将肌幼虫分别培养0.5、1和2 h,从肌幼虫Ts-ODC基因转录水平、酶活性及存活率等方面分析Ts-ODC基因干扰对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响;将Ts-ODC基因被干扰的旋毛虫肌幼虫感染小鼠,在7和42 d时分别收集成虫和肌幼虫,分别计算其减虫率;将子一代肌幼虫在pH 2.5的酸性条件下培养2 h,计算其存活率,对Ts-ODC基因干扰的遗传性进行分析。结果显示,Ts-ODC siRNA-757为最佳干扰分子,转染12 h、浓度为2μmol·L^(-1)培养3 d时为最佳干扰条件;各组pH 2.5培养2 h时Ts-ODC基因转录水平最高,pH 1.5培养2 h时虫体的存活率明显低于其他培养条件(P<0.01),pH 4.5培养0.5 h时虫体体内酶活性最高;转染Ts-ODC siRNA-757的肌幼虫接种小鼠后,7 d时成虫和42 d时肌幼虫的减虫率分别为58.95%和65.91%;其子一代肌幼虫在pH 2.5的培养液内培养2 h时其存活率为49%。综上表明,旋毛虫肌幼虫体内具有鸟氨酸依赖型抗酸系统,本研究首次通过siRNA技术干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因,且证实干扰Ts-ODC基因可降低肌幼虫抗酸能力,为后期旋毛虫病的防治提供新思路。