摘要：转录因子SOX2(sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254~2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。

摘要：应用PCR SSCP的方法对大白猪、长白猪和杜洛克猪的Kappa阿片受体 (Kappaopioidreceptor,简称KOR)基因进行单核苷酸多态性检测和分析 ,研究Kappa阿片受体基因作为候选基因 ,影响母猪行为规癖性状的可能性。根据Kappa阿片受体基因外显子的部分序列设计 3对引物 ,发现F1/R1引物对扩增的片段有多态性。对两种纯合子片段克隆并测序表明 ,mRNA第 10 5处有一C→T的单碱基突变 ,为沉默突变。统计结果发现 ,3种基因型 (AA、AB、BB)在各品种中的分布不一致 ,χ2 独立性检验差异极显著 (P <0 0 1)。将 3种基因型同行为规癖性状进行统计分析 ,结果表明BB基因型与其他两种基因型相比表现较高的静止站立行为 ,同AA和AB型比较差异极显著 (P<0 0 1) ,其他 4种行为性状基因型间差异不显著。因此 。

摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase,PPCK)是一种钙不依赖的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)类蛋白激酶,参与碳氮代谢等多个生物学过程,然而其在碱胁迫反应中的作用尚未见报道。本研究在前期野生大豆碱胁迫基因表达谱数据基础上,采用同源克隆的方法分离野生大豆(Glycine soja)PPCK1基因,该基因编码的氨基酸序列与大豆(Glycine max)PPCK1蛋白(AAQ83695.1)具有99%的相似性,被命名为GsPPCK1。在50mmolL–1NaHCO3胁迫处理3h内,根和叶中GsPPCK1基因上调表达,属碱胁迫早期应答基因。通过农杆菌介导法对肇东苜蓿进行遗传转化,并对RT-PCR阳性的超表达转基因株系进行耐碱性分析,在100mmolL–1NaHCO3处理15d后转基因株系生长状态良好,而非转基因对照株系明显萎蔫、失绿、甚至死亡;转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05),而叶绿素含量和根系活力显著高于非转基因对照(P<0.05),说明超量表达GsPPCK1基因增强了苜蓿的耐碱能力。以上结果表明,GsPPCK1参于植物耐碱胁迫反应过程,在碱胁迫基因工程研究领域具有良好的理论和实际应用意义。

摘要：次氯酸钠(NaClO)离析法主要用于植物叶片表皮的观测,在研究过程中发现该法也可用于叶片脉序的观测。以甘蓝(Brassica oleracea ***)为实验材料,采用二次正交设计方法对水煮时间、NaOH浓度、NaOH处理时间、NaClO浓度、NaClO处理温度和处理时间等各种处理条件进行优化筛选,以期得到适合于甘蓝叶片脉序观测的最佳处理条件组合。实验结果表明,新鲜甘蓝叶片水煮3分钟,10%的NaOH溶液60°C水浴处理2.5小时,3%的NaClO溶液40°C水浴离析2小时,叶片脉序的观测效果最佳。

摘要：旨在通过单因素试验对接骨木镰刀菌产呕吐毒素的温度、时间、pH、碳源及碳源浓度进行筛选,应用响应面法设计试验,依据Box-Behnken中心组合原理筛选得到影响接骨木镰刀菌产呕吐毒素的关键因素。以呕吐毒素含量为响应值借助Design-Expert v8.0.6软件分析各影响因子与响应值的相互作用,预测最适条件并验证。试验得到一个拟合程度高、误差小的模型,得出呕吐毒素含量最大时的条件为:葡萄糖为碳源、培养温度26.19℃、pH 6.12、培养时间25.38 d。在此条件下,呕吐毒素含量预测值为2.50 ng/mL,实际测得呕吐毒素含量为2.57 ng/mL。低浓度呕吐毒素处理能减小马铃薯病斑面积20%。

摘要：丁香酚合成酶(eugenol synthase,EGS)是北细辛(Asarum heterotropoides)主要活性成分甲基丁香酚体内合成途径中的关键酶之一。该研究根据北细辛转录组数据库中筛选到的序列设计特异引物,以RT-PCR法扩增获得北细辛丁香酚合成酶基因(AhEGS)的开放阅读框(ORF)序列,进行了相应的生物信息学分析。同时运用实时定量PCR法分析AhEGS在不同发育时期(幼叶期、花期、果期)和不同组织部位(叶、根茎、根)中的表达谱,并进行原核表达分析。结果显示:(1)AhEGS基因ORF序列长为951 bp,编码316个氨基酸,理论分子量为34.93 kD,等电点为6.19,AhEGS蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽序列;同源序列比对发现,北细辛AhEGS与月季RcEGS(AFQ98278.1)同源性最高。(2)实时定量PCR分析表明,AhEGS基因在北细辛幼叶期的根中表达量最高。(3)成功构建了原核表达载体pET28a-AhEGS-BL21,经pET28a-AhEGS重组子转化*** BL21(DE3),SDS-PAGE检测显示在大肠杆菌(Escherichia coli,***)中诱导产生了35 kD左右的特异性蛋白,与理论分子量一致;最佳诱导条件为16℃、14 h,IPTG浓度为0.2 mmol/L。该研究首次克隆了北细辛的EGS基因,构建了原核表达载体,筛选出该蛋白最佳诱导条件,研究结果为北细辛甲基丁香酚代谢工程的应用奠定基础。

摘要：HSSP是用大豆密码子改造的10 kD玉米醇溶蛋白基因。在前期研究中,从获得的转基因大豆中筛选到1份单拷贝转基因材料GSDH5。该研究采用染色体步移法获取转基因大豆GSDH5的T-DNA插入位点的左边界旁侧序列,对获得的左边界旁侧序列进行分析,设计特异性引物,建立转基因大豆GSDH5特异性检测方法;采用Real-time PCR检测外源基因在转基因大豆不同组织部位(根、茎、叶、花和种子)中的表达量,采用RT-PCR和Western blot检测外源基因在转录和翻译水平上的遗传稳定性,并对转基因大豆GSDH5中的粗蛋白、含硫氨基酸含量及主要农艺性状进行测定分析,为培育高含硫氨基酸转基因大豆新品种奠定基础。结果表明:(1)分子鉴定显示,外源基因HSSP和筛选标记基因Bar成功整合到受体大豆‘东农50’基因组中,且以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。(2)HSSP基因成功插入到大豆基因组1号染色体非编码区52873883 bp处。(3)HSSP基因在转基因大豆GSDH5的种子中特异性表达,且在T 2~T 4代转基因大豆中能够稳定遗传并表达。(4)‘东农50’粗蛋白含量在41.53%~43.32%之间,GSDH5粗蛋白含量在40.18%~43.03%之间,两者相比无显著差异;GSDH5种子中硫氨基酸占种子干样的比例为1.35%,占种子蛋白的比例为3.14%,与转基因受体品种‘东农50’相比,占比显著升高,分别增加了11%和16%。(5)转基因大豆GSDH5植株与受体品种‘东农50’在单株荚数、百粒重、株高、结荚习性、花色、叶形等方面均无显著差异,证明HSSP基因的插入对大豆植株的生长发育无不良影响。研究认为,转基因大豆GSDH5材料具备进一步培育成高含硫氨基酸大豆新品种的潜力。

摘要：盐碱胁迫是影响植物生长、发育和产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料。为了获得在植物渗透胁迫反应中起关键作用的功能基因,研究以耐盐碱东北野生大豆(Glycine sojaL.G07256)为试材,利用前期构建的野生大豆碱胁迫基因芯片表达谱,从中选出一个在盐碱胁迫早期上调表达,经Blast分析预测属于C2H2类型的锌指转录因子(探针号Gma.17534.1.S1_at),命名为GsZFP1。对GsZFP1基因进行芯片结果的sqRT-PCR验证,并通过同源克隆的方法克隆得到GsZFP1的cDNA序列。利用"ORF Finder"及ExPASy的ProtParam工具分析表明GsZFP1蛋白长度为325 aa,分子质量约35.14 ku,预测等电点为9.99。其锌指结构特征为Cys-X2-Cys-X3-Phe-X5-Phe-X2-His-X3-4-His,并且不含QALGGH保守结构域。该基因是野生大豆中首次被发现的不含QALGGH motif C2H2类型的锌指蛋白,并且参与到非生物胁迫反应。该结果将为研究GsZFP1基因在非生物胁迫中的功能,并为认识不含QALGGH保守结构域的C2H2类型的锌指蛋白在非生物胁迫中的作用奠定基础,为耐渗透胁迫基因工程研究提供潜在的基因资源,为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。

摘要：本试验从微生态学考虑筛选并组合了发酵玉米秸的微生物种系。对影响混合微生物发酵玉米秸的温度、时间、水分三因素作交叉分组设计；通过ＮＤＦ、ＡＤＦ含量分析，探索了各因素有交互作用对秸秆发酵效果的影响。初步明确：温度为１５、２０、２５、３０℃，料水比为１：１、１：２时，发酵时间１５、３０ｄ可行。

摘要：目的设计原核表达抗人白细胞介素．1B单链抗体（IL-1βscfv）与TNF．仪可溶性受体的融合蛋白，并分析其生物学活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。方法利用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增了人肿瘤坏死因子I型受体胞外区基因片段，与抗人IL-1βscfv通过抗体铰链区融合，克隆至pET27b（＋）表达载体中，构建成pET-IL-1scfv：TNFR1质粒；转化大肠杆菌Rosetta进行表达。从包涵体中纯化得到IL-1scfv：TNFR1蛋白，进行IL-1scfv：TNFR1的鉴定及活性检测。结果ELISA结果证明，IL-1scfv：TNFRl可以分别结合hIL-1β和hTNF-α，并呈现剂量依赖性，表明IL-1scfv：TNFR1的单链抗体部分和可溶性受体部分可以各自形成正确的空间构象；免疫斑点分析证明，IL-1scfv：TNFRl与hTNF—α结合后仍可以结合hIL-1β，具有同时结合hlL-1β和hTNF-α的两种靶分子的能力，表明IL-1scfv：TNFR1的两个部分不会相互影响与靶分子的结合。活性测定结果表明，IL-1scfv：TNFRl可以有效封闭肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒效应，具有显著抑制hlL-1β促进L929细胞增殖的活性，IL-1scfv：TNFR1对两种靶分子的拮抗作用均呈现明显的剂量依赖性。结论成功构建了能够同时结合hIL-1β和hTNF-α两种靶因子的双特异性IL-1scfv：TNFR1融合蛋白，并能有效抑制hTNF-α和IL-1β的生物活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。