摘要：目的设计原核表达抗人白细胞介素．1B单链抗体（IL-1βscfv）与TNF．仪可溶性受体的融合蛋白，并分析其生物学活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。方法利用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增了人肿瘤坏死因子I型受体胞外区基因片段，与抗人IL-1βscfv通过抗体铰链区融合，克隆至pET27b（＋）表达载体中，构建成pET-IL-1scfv：TNFR1质粒；转化大肠杆菌Rosetta进行表达。从包涵体中纯化得到IL-1scfv：TNFR1蛋白，进行IL-1scfv：TNFR1的鉴定及活性检测。结果ELISA结果证明，IL-1scfv：TNFRl可以分别结合hIL-1β和hTNF-α，并呈现剂量依赖性，表明IL-1scfv：TNFR1的单链抗体部分和可溶性受体部分可以各自形成正确的空间构象；免疫斑点分析证明，IL-1scfv：TNFRl与hTNF—α结合后仍可以结合hIL-1β，具有同时结合hlL-1β和hTNF-α的两种靶分子的能力，表明IL-1scfv：TNFR1的两个部分不会相互影响与靶分子的结合。活性测定结果表明，IL-1scfv：TNFRl可以有效封闭肿瘤坏死因子对L929细胞的细胞毒效应，具有显著抑制hlL-1β促进L929细胞增殖的活性，IL-1scfv：TNFR1对两种靶分子的拮抗作用均呈现明显的剂量依赖性。结论成功构建了能够同时结合hIL-1β和hTNF-α两种靶因子的双特异性IL-1scfv：TNFR1融合蛋白，并能有效抑制hTNF-α和IL-1β的生物活性，为类风湿关节炎的治疗提供新的候选药物。

摘要：目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在*** Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。

摘要：目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。