摘要：目的:运用RNAi技术下调平衡型核苷转运蛋白1(hENT1)的表达,观察hENT1下调后5-氟尿嘧啶(5-FU)对胰腺癌Panc-1细胞的毒性改变情况。方法:设计并合成能表达特异性针对hENT1的shRNA(smallhairpinRNA)的DNA序列,构建pSilence-hENT14.1-CMVneo质粒。用脂质体法将pSilence-hENT14.1-CMVneo质粒转染胰腺癌Panc-1细胞,并以含G418(600μg/mL)的培养液筛选阳性转染细胞(pSilence-hENT14.1-CMVneoPanc-1)。RT-PCR检测下调pSilence-hENT14.1-CMVneoPanc-1细胞hENT1mRNA表达的效果及稳定性。MTT法检测细胞在含5-FU(0～1.56×106nmol/L)的培养液中48h后的生存率,并计算IC50。结果:测序显示重组质粒pSilence-hENT14.1-CMVneo中插入片段序列正确。RT-PCR结果显示,pSilence-hENT14.1-CMVneoPanc-1细胞hENT1mRNA表达水平下调,并在两个月内(共传代15次)保持相对稳定。MTT结果显示,pSilence-hENT14.1-CMVneoPanc-1细胞组氟尿嘧啶的IC50显著下降,为Panc-1细胞组IC50的51.52%(P<0.01)。结论:用RNAi方法下调hENT1mRNA表达可增强5-FU对胰腺癌细胞的毒性。

摘要：目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P<0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。

摘要：目的构建S100P基因短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,并在胃癌细胞中鉴定其沉默效率。方法设计S100P基因特异性的RNA干扰序列,构建shRNA慢病毒载体,与S100P过表达质粒共转染293T细胞。随后筛选有效的shRNA慢病毒载体,与pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,包装病毒,感染胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901。采用RT-PCR和Western blot检测S100P基因的敲减效率。结果成功构建S100P基因的shRNA慢病毒载体,MGC-803和SGC-7901细胞中S100P基因的mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05)。结论成功构建的S100P基因shRNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。