摘要：目的运用逆转录解旋酶等温扩增(RT-tHDA)和侧流层析技术,建立新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测新方法。方法收集2020年1至4月东部战区总医院基础医学实验室共143份2019-nCoV PCR阴性核酸标本和20份PCR阳性核酸标本。针对2019-nCoV N基因和E基因保守区序列各设计5对引物,扩增产物进行凝胶电泳分析,筛选出RT-tHDA最佳引物。分别扩增高浓度(5×10^(5)拷贝/ml)、低浓度(5×10^(2)拷贝/ml)模拟标本,利用侧流层析试纸条(LFD)检测RT-tHDA扩增产物,使结果可视化。优化显色和扩增时间,建立tHDA-LFD最佳反应体系。该方法检测各低、中、高3种浓度的模拟标本15次,以阳性符合率来评估方法学精密度。制备模拟标本评价方法学检测限。分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒229E,评价tHDA-LFD法的交叉反应性。采用tHDA-LFD法检测本实验室收集保存的163份标本,进行临床诊断效能评价。结果采用一步法RT-tHDA结合LFD,建立扩增时间为60 min的2019-nCoV核酸检测方法。该方法检测3种浓度的模拟标本,阳性符合率为100%,精密度和重复性较好,且与其他6种呼吸道病原体均未出现交叉反应。该方法检测N基因、E基因的最低检测限均为5×10^(2)拷贝/ml。诊断效能评价结果显示,该法敏感度为95.00%(19/20),特异度为100.00%(143/143),阳性预测值为100.00%(19/19),阴性预测值为99.31%(143/144)。和金标准qPCR法相比,两种方法的Kappa值为0.971(P<0.0001),一致性较好。结论本研究成功建立了基于tHDA-LFD法的2019-nCoV可视化检测方法。

摘要：目的建立并评价多重PCR联合毛细管电泳技术(mPCR-CE)同时检测碳青霉烯酶基因bla_(KPC)、bla_(NDM)、bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的方法。方法设计特异性引物,建立多重PCR扩增体系,利用毛细管电泳检测扩增产物。以携带bla_(KPC)、bla_(NDM)、bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的细菌作为阳性对照菌株,以携带其他β-内酰胺酶基因细菌作为阴性对照,用于mPCR-CE的灵敏度、特异性评价。收集68株碳青霉烯耐药菌株,利用mPCR-CE方法进行检测,并与PCR扩增后测序结果比较。结果mPCR-CE检测携带bla_(KPC)、bla_(NDM)和bla_(VIM)细菌最低检测限均为1.5×10^(2) CFU/mL,检测携带bla_(OXA-48)细菌为1.5×10^(3) CFU/mL,并且与携带其他β-内酰胺酶基因的细菌无交叉反应。经mPCR-CE检测,68株临床分离菌株中37株携带bla_(KPC),8株携带bla_(NDM),未检测到携带bla_(OXA-48)和bla_(VIM)的菌株,结果与PCR扩增后测序结果完全一致。结论mPCR-CE可用于临床分离菌株的主要碳青霉烯酶基因检测。