摘要：从已获得的运用抑制消减杂交技术 (SuppressionSubtractiveHybridization ,SSH)分离、克隆和筛选代表 8 细胞早期胚胎和紧密化 8 细胞胚胎差别表达基因的ESTs片段 (GenBank登录号 :BQ740 2 63、BQ740 2 51)入手 ,经比较二者的同源性发现这两个EST末端反向互补 ,拼接成一个cDNA片段 ,经分析此序列包含一个完整的阅读框 ,提交给GenBank ,登录号为AY13 4 859。根据此序列设计引物从小鼠 8 细胞紧密化胚胎cDNA中经PCR扩增出目的片段 ,克隆入pUCm T载体后测序而获得全长cDNA ,为小鼠植入前胚胎紧密化相关基因Crg1,分析比较证明Crg1基因与AY13 4 859基本吻合。Crg1基因的cDNA全长为 810bp ,只有一个外显子 ,编码由 150个氨基酸组成 ,分子量理论值为 17 67kD的蛋白质。与最新的小鼠基因组工作草图进行电子杂交 ,该基因被定位在小鼠的 14号染色体上。RT PCR实验证明在小鼠植入前各个时期的胚胎、小鼠胚胎干细胞中均有表达 ,在小鼠胚胎成纤维细胞中没有表达。半定量RT PCR实验证明Crg1基因在紧密化胚胎中表达较 8 细胞胚胎高。采用Northern blot手段分析Crg1基因在成年小鼠的 8种组织中的表达情况 ,结果表明该基因只在小鼠卵巢中有微弱的表达 ,转录本大小为 1 2kb ,而在成年小鼠的脑、心脏、肾、睾丸、肝脏、肺、

摘要：目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建***干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。

摘要：目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。

摘要：目的:制备携带Bclxl基因的重组腺相关病毒,并鉴定其感染细胞有效性。方法:抽提BALB/c小鼠脾脏总RNA,通过RT-PCR获得cDNA,然后设计引物通过PCR获得Bclxl基因的编码序列。将得到的Bclxl编码序列插入腺相关病毒质粒pAAV-MCS中的多克隆位点,从而构建出重组腺相关病毒质粒pAAV-Bclxl。将质粒转染细胞后使用Western Blot和流式分析检测Bclxl蛋白的表达。进一步包装制备了携带Bclxl基因的重组腺相关病毒颗粒,用其感染HT1080细胞后用流式细胞仪分析了感染前后细胞中Bclxl基因的表达情况。结果:质粒转染后细胞中Bclxl蛋白的表达水平显著高于转染前,病毒感染后细胞中Bclxl蛋白的表达水平显著高于感染前。结论:携带Bclxl基因的重组腺相关病毒颗粒包装成功,能高效感染细胞,为后续的遗传改造树突细胞打下了基础。