摘要：为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70~81位、118~140位,VP1 G-H环131~157位、C末端188~212位,A/WH/CHA/09 VP1 43~48位、VP3 55~72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。

摘要：为了克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因,根据GenBank中登录的PEDV(CV777株)的N基因序列设计1对特异引物,提取阳性临床样品的总RNA,通过RT-PCR方法获得PEDV的N基因。将N基因定向克隆至表达载体pET-28a-His-Sumo中,酶切和测序鉴定表明获得了阳性重组表达质粒pET-28a-His-Sumo-N。将阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,并进行IPTG诱导表达,用SDSPAGE和Western-blot对表达的目的蛋白进行分析。SDS-PAGE检测结果表明获得了60.0ku的表达产物,与目的蛋白大小符合;Western-blot结果显示,纯化后的目的蛋白能与PEDV阳性血清发生特异反应。表明成功对PEDV-N蛋白进行了原核表达,且纯化后的蛋白质具有良好的反应原性。

摘要：根据福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点的序列,以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板扩增了marA基因序列。将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α。鉴定成功获得目的片段后,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切并与载体pET-30a连接,构建原核表达质粒pET-30a-marA,并将其转化宿主菌BL21(DE3)pLys,用IPTG诱导其表达。SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-30a-marA可成功地在大肠杆菌中表达MarA蛋白。Western-blotting检测证明,该蛋白能与志贺菌阳性血清发生特异性反应。

摘要：口蹄疫表位疫苗既不存在病毒复制风险,又能同时展示多个变异株的优势表位,是具有巨大发展潜力的新型疫苗。本文将从口蹄疫病毒的抗原表位,表位疫苗的设计和优化以及表位疫苗的应用等方面进行综述,为合理设计和研发有效的口蹄疫表位疫苗提供参考。

摘要：CD58在机体免疫系统中具有重要作用,本研究通过对人、绵羊CD58 mRNA序列比对,设计兼并引物,应用反转录PCR技术克隆猪CD58基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,同时运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明:克隆的猪CD58 cDNA全长800 bp,ORF为735 bp;将其在大肠杆菌中进行表达,产物可被CD58抗血清识别;序列比对结果显示猪、羊和人的CD58核苷酸序列及氨基酸序列同源性并不高,但蛋白结构预测表明三者蛋白结构非常相似,尤其是V区三维结构,这是异种动物淋巴细胞和红细胞发生黏附的分子基础。该研究为CD58作为疫苗佐剂或免疫调节药物在临床中的应用、进一步研究CD58分子结构及CD2-CD58复合物激活免疫系统的机理奠定了基础。

摘要：本研究拟解析我国羊巴贝斯虫trap基因的结构特征,并以其为分子标志开展遗传进化分析,为理清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供数据。用公布的巴贝斯虫trap基因序列BLAST两个羊巴贝斯虫全基因组本地数据库,以获得的保守序列片段为模板,设计PCR引物;克隆我国分离的6株羊巴贝斯虫trap基因全长序列,分析其序列结构特征;比对序列相似性,构建系统发生树,分析其遗传进化关系。结果克隆获得6株羊巴贝斯虫trap基因,分析结果显示,其具有3、4、5个内含子的三种内含子数目,预测的开放阅读框(ORF)大小分别为1 944、2 100/2 142和2 286bp;氨基酸序列分析显示,其都具有TRAP蛋白家族特征性的vWFA、TSR、跨膜域和CTD结构域;进化关系分析显示,感染我国羊的巴贝斯虫被分成3组,组内序列相似性为99.8%~100%,而组间为43.6%~74.6%。系统发生树上6株羊巴贝斯虫被分到两大枝,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,而且莫氏巴贝斯虫又被分成两小枝。6株羊巴贝斯虫trap基因结构存在差异,但其蛋白特征性的结构域较为保守;我国分离的羊巴贝斯虫为两个种,但莫氏巴贝斯虫中可能存在两个亚种。

摘要：为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。

摘要：目的建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法。方法以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel⁃miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel⁃miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只经口感染1000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果。结果电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2∶1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P<0.01)。ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95%,AUC为0.9550,似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性。结论建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel⁃miR1,具有良好的应用潜力。

摘要：用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。

摘要：为鉴定兔豆状囊尾蚴(***)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从***总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。