摘要：目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。

摘要：目的研制一种可用于疫区现场快速诊断家畜日本血吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条。方法设计重组蛋白G并在大肠杆菌中表达,得到重组蛋白。对重组蛋白G进行胶体金标记并制备金标垫,分别用可溶性虫卵抗原(SEA)和重组蛋白G划线,作为检测线和质控线。采用组装的试纸条检测标准阴、阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清,以及粪检阴、阳性的绵羊与水牛血清,评估其灵敏度和特异度;利用组装的试纸条检测前后盘吸虫病病牛血清,评价其交叉反应性。结果成功构建了重组蛋白G的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本血吸虫感染BALB/c鼠、新西兰大白兔、水牛、绵羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的灵敏度、特异度均为100%;检测绵羊血清的灵敏度为100%,特异度为88.46%;检测水牛血清的灵敏度为94.44%,特异度为100%;其与前后盘吸虫交叉反应率为5.88%。结论成功研制能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条,其检测家畜血吸虫感染的灵敏度和特异度均较高。

摘要：链球菌蛋白G(streptococcal protein G,SPG)具有与多种动物IgG结合的特性。本研究对链球菌蛋白G进行生物学分析,设计重组蛋白G的基因序列,构建重组蛋白G的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,得到带有GST标签的融合蛋白,通过GST亲和层析纯化蛋白。Western blot结果显示,重组蛋白具备与IgG结合的能力。ELISA测定重组蛋白与牛、山羊、兔、鼠4个物种IgG的亲和力,显示重组蛋白G的亲和力普遍高于商品化链球菌蛋白G。本研究成功重构并表达、纯化了链球菌重组蛋白G,得到其与4个物种抗体IgG的亲和力常数,有助于SPG在其他相关研究中的应用。

摘要：目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体连接后并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组质粒PET-28(a)-Cap,对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白,通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果重组质粒在大肠杆菌中成功表达,蛋白质分子量约为17.4 k Da,与预期相符;Western blot结果显示,重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合。结论PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立,进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础。

摘要：为筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的因子,本研究以抱雌沟蛋白(gynecophoral canal protein ofSchistosoma japonicum,SjGCP)为诱饵蛋白构建了用于酵母双杂交筛选系统的重组质粒。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因序列设计引物,经过PCR扩增、酶切回收,与经相应酶切的线性化载体pBGKT7-BD连接构建重组质粒。随后将重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP转化酵母菌株,测定融合蛋白BD-SjGCP在酵母菌中的自激活活性、对酵母菌生长的影响及在酵母中的表达情况。结果显示构建的重组诱饵蛋白质粒pGBKT7-BD-SjGCP能够在酵母细胞内正确表达,没有独自激活报告基因表达的活性,且其表达对酵母细胞没有毒性,不影响酵母细胞的生长。可见,重组质粒pGBKT7-BD-SjGCP可用于筛选与血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的物质。