摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近两年来流行于我国大部分省份的"猪高热综合征"的主要病原体.该病毒在繁殖过程中具有遗传多变性和高频率的抗原突变.如何设计有效的疫苗来防治持续多变的流行变异株是研究者所关注的焦点.本研究中我们构建了Ⅱ型PRRSV弱毒株的感染性cDNA克隆,并对编码结构蛋白的ORF1和编码结构蛋白的ORF2之间插入几个酶切位点.通过RT-PCR和DNA测序以及分子克隆方法,获得了细胞致弱株(APRRS)的全长cDNA克隆.APRRSV基因组RNA为15521个核苷酸(不包括poly(A)尾).与PRRSV Nsp株和疫苗株的相似性均为99.7%.根据测序结果,利用基因组上的酶切位点将全长PRRSV cDNA克隆到pBlueScript载体中,在病毒5′末端引入T7启动子序列.为了区分重组病毒和亲本病毒,在ORF5编码区引人MluⅠ酶切位点.将最初构建的全长cDNA和带有MluⅠ酶切位点的cDNA分别体外转录成RNA后转染MA-104,均能够观察到典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE).拯救的重组病毒与亲本病毒有着相同的病毒学特性.通过突变PCR的方法将编码非结构蛋白基因ORF1和编码结构蛋白基因ORF2-7之间的编码区分离,从而构建了克隆***体外转录产物具有感染性,而且拯救的病毒与亲本病毒具有相同的病毒学特性.本研究为构建嵌合病毒作为疫苗候选株以此对遗传多变的PRRSV毒株提供有效的交叉保护提供了宝贵的工具,同时也为建立PRRSV为基因表达载体来构建针对其他重要的猪源疾病重组疫苗搭建了一个很好的平台.

摘要：根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中,建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12 704个核苷酸,与EAVBucyrus分离株的同源性为99.1%;全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。