摘要：本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。

摘要：尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

摘要：为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

摘要：Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(PCV2)的主要结构蛋白,构成病毒的核衣壳,是PCV2的主要免疫保护性抗原,在PCV2血清学诊断中具有重要意义。本研究根据PCV2的ORF2基因序列设计特异性引物,通过PCR方法扩增得到去核定位信号肽的ORF2基因,并通过同源重组将其克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,经测序鉴定成功获得重组质粒pCold-Ⅰ-Cap。将重组质粒转化至感受态细胞BL21中进行表达,通过考马斯亮蓝染色以及免疫印迹试验检测Cap蛋白的表达,同时将纯化后的重组蛋白通过优化反应条件建立检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组去核定位信号肽Cap蛋白可溶性表达且可以与PCV2阳性血清特异性结合,通过探索不同蛋白包被浓度以及不同一抗孵育浓度初步建立了间接ELISA检测方法,进而为PCV2抗体的有效监测奠定基础。

摘要：本研究针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒,建立针对TGEV N基因的Taq Man荧光定量PCR检测方法,用于临床快速诊断和实验室检测。结果显示,该方法特异性好,与其他具有相似临床症状的猪源病毒相比,不存在交叉反应,Ct值在1×10^(9)~1×10^(1)copies/μL的范围内具有很好的线性关系,R^(2)=0.99。该方法最低检测限为10 copies/μL,标准曲线为y=-3.0587x+37.7,斜率为-3.0587。该方法重复性好、敏感度高、特异性强,适用于临床样品中TGEV抗原核酸的检测和实验室病毒生长特性的研究,为准确定量及诊断TGEV提供了有效的试验手段和检测工具。

摘要：为了快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swin fever virus,ASFV),本文根据我国流行毒株ASFV SY18(GenBank ID:MH766894.1)已公布的K205R基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对K205R基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法。经过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测试验分析显示,本文建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品在1×10^(11)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-2.797,检测下限为10^(2)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.53774%,重复性好。本方法适用于临床样品及本实验室构建的表达ASFV K205R基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对ASFV快速检测及ASF早期诊断有重要意义。

摘要：为了建立一种可以同时鉴定大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)与O_(157)血清型的快速高效多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)、O_(157)血清型的O抗原合成基因簇特异性靶标基因序列,设计合成4对PCR引物,优化引物浓度及反应条件,建立多重PCR检测方法。然后,分析多重PCR方法的特异性、敏感性,并利用建立的多重PCR方法检测大肠杆菌临床分离株验证该方法的可靠性。特异性结果显示,多重PCR方法可有效鉴定大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)、O_(157)血清型,而检测其他血清型大肠杆菌及菌种时无扩增条带,表明多重PCR方法具有较好的特异性。敏感性结果显示,多重PCR方法检测大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)、O_(157)血清型的菌液和DNA的最低检测限分别为10^(5)CFU、10^(5)CFU、10^(3)CFU、10^(3)CFU和1 ng、100 pg、10 pg、10 pg。临床分离株检测结果显示,与传统血清凝集试验相比,多重PCR方法更准确、可靠。本研究成功建立了一种可特异、灵敏、快速鉴定大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)与O_(157)血清型的多重PCR方法,为大肠杆菌O_(8)、O_(9)、O_(149)与O_(157)血清型检测和流行病学调查提供了新的技术手段。

摘要：为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13L基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验与临床样品检测,建立三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示,以B646L、EP402R和MGF360-13L重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R^(2))分别为0.995、0.997和0.997;建立的方法与多种猪常见病原不存在交叉反应,特异性良好;对B646L、MGF 360-13L与EP402R基因的检测下限均为10^(2.5) copies/μL,变异系数均<2%,该方法灵敏度高;当临床样品稀释至10^(-5)时,即滴度为10^(2.5)TCID_(50)/mL时仍能检测到病毒粒子,具有较高的临床使用价值。本研究建立了一种高效、灵敏、特异的ASFV分子检测方法,对ASF风险预警具有重要意义。

摘要：为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfI(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法。结果显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为103cfu/mL);利用建立的检测方法从上海、山东、安徽和辽宁的临床病料分离出63株沙门菌,其中33株为肠炎沙门菌,9株为鼠伤寒沙门菌,2株为鸡白痢沙门菌,其余19株为沙门菌其他血清型。研究表明,该四重PCR检测方法可以准确且高效地检测肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌,为兽医临床沙门菌快速检测提供技术支撑。

摘要：Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。