摘要：根据GenBank中BVDV-1、BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDV与CSFV的Nested-PCR检测方法;确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDV标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。结果表明,该方法具有较好特异性;其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量;经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%;牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDV污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。

摘要：针对RPL11基因设计三条不同的shRNA,并分别克隆至带绿色荧光标签的pRNAT-U6.1载体,以用于构建RPL11稳定敲减的细胞系。将重组质粒转染至HeLa细胞中并加入G418进行筛选,随后通过有限稀释法将阳性细胞亚克隆纯化。将扩大培养的亚克隆细胞进行Western blot和qPCR实验验证获得RPL11基因稳定敲低的细胞株。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和Puromycin标记法测定RPL11基因稳定敲低细胞系的生长活力和新生蛋白合成能力,结果表明,RPL11基因稳定敲低后并不影响细胞的活力和新生蛋白合成能力,该细胞系为后续研究RPL11的非核糖体功能奠定了基础。

摘要：为了实现微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)E2F样结构域包含转录因子编码基因cpeld的原核和真核表达,设计2对特异性引物,以***卵囊cDNA为模板,PCR扩增得到cpeld基因,将其分别插入pET32a和p3XFLAG-CMV14载体。同时设计引物,扩增微小隐孢子虫类钙调蛋白(*** calmoduin-like proteins)的编码基因CpCML,插入pcmv-HA载体。将鉴定正确的重组质粒分别转入BL21(DE3)和293T细胞进行表达,Western blot观察重组蛋白的反应原性。结果显示,成功构建了重组原核表达质粒pET32a-cpeld和真核表达质粒p3XFLAG-CMV14-cpeld以及pcmv-HA-CML;SDS-PAGE显示,重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达出了分子质量约为55 ku的重组蛋白;Western blot分析显示,原核表达的重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体,真核表达重组CpELD和CpCML蛋白能分别与抗FLAG和HA单克隆抗体反应。结果表明,成功实现了cpeld基因的原核和真核表达以及CpCML基因的真核表达,表达产物具有良好的反应原性,为后续开展隐孢子虫CpELD和CpCML的功能和作用机制研究、新型的防控技术研发奠定了基础。

摘要：流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis，JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病，严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域，本研究设计了3对引物，将E蛋白分成3个大段，分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa），又将EF1分成4个相互重叠的小片段，分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa），将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达，各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定，GST-EF2反应性最强，GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱，而GST-EF3反应性最弱，GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域，在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定，为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。

摘要：根据已发表的牛型布氏杆菌(Brucella abrotus)基因序列设计一对特异性引物,以***19株基因组为模板,通过PCR扩增GroEL基因,经T-A克隆后进行序列测定和分析。结果表明,GroEL基因全长1 641bp,编码546个氨基酸。将GroEL定向克隆至表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-LGroEL,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为81 kDa。经Western blot检测,牛布氏杆菌阳性血清中有GroEL抗体存在,表明该蛋白具有免疫原性。对重组表达蛋白His-GroEL进行酶促活性检测,结果表明该蛋白在体外具有催化ATP水解的酶活性和促进乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)复性的功能。

摘要：目的研制一种可用于疫区现场快速诊断家畜日本血吸虫感染的胶体金免疫层析试纸条。方法设计重组蛋白G并在大肠杆菌中表达,得到重组蛋白。对重组蛋白G进行胶体金标记并制备金标垫,分别用可溶性虫卵抗原(SEA)和重组蛋白G划线,作为检测线和质控线。采用组装的试纸条检测标准阴、阳性BALB/c鼠与新西兰大白兔血清,以及粪检阴、阳性的绵羊与水牛血清,评估其灵敏度和特异度;利用组装的试纸条检测前后盘吸虫病病牛血清,评价其交叉反应性。结果成功构建了重组蛋白G的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。以重组蛋白G制备的试纸条可用于检测日本血吸虫感染BALB/c鼠、新西兰大白兔、水牛、绵羊血清抗体。该试纸条检测日本血吸虫感染小鼠与兔血清的灵敏度、特异度均为100%;检测绵羊血清的灵敏度为100%,特异度为88.46%;检测水牛血清的灵敏度为94.44%,特异度为100%;其与前后盘吸虫交叉反应率为5.88%。结论成功研制能检测多种家畜血吸虫病的胶体金免疫层析试纸条,其检测家畜血吸虫感染的灵敏度和特异度均较高。

摘要：为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。

摘要：为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。

摘要：目的:利用现代分子生物学方法,建立一种准确率更高的犬疥蟎病的诊断方法,为犬疥蟎病的治疗提供诊断基础。方法:收集犬疥蟎,抽提总RNA并将其反转录为cDNA;以该cDNA为模板,参考其它哺乳动物副肌球蛋白的基因序列特征,设计引物扩增含有多个抗原表位的犬副肌球蛋白的部分cDNA序列;构建原核表达载体,表达及纯化目的蛋白片段;以纯化的目的蛋白片段为抗原,免疫BALB/c小鼠制备抗血清;以制备的抗血清为一抗,通过间接ELISA法测定患病犬痂皮组织中疥蟎副肌球蛋白片段的存在,进而判断是否有疥蟎感染。结果:成功构建了副肌球蛋白的原核表达载体,命名为pET28a-Para-202;通过诱导、纯化获得了重组蛋白;该重组蛋白抗原免疫小鼠后获得高效价的抗血清;以该抗血清为工具,通过间接ELISA法极大提高了犬疥蟎感染的诊断率,为该病治疗提供了重要的参考依据。

摘要：为筛选敏感、特异的住肉孢子虫(Sarcocystis spp.)PCR检测方法,对以住肉孢子虫18S rRNA、28S rRNA和线粒体细胞色素C氧化酶I基因(cox 1)的部分片段为靶基因设计的3套引物建立的PCR方法进行敏感性和特异性试验,并对田间采集的100份牛源和猪源肌肉样品进行检测。结果显示,以18S rRNA和28S rRNA为靶基因的PCR检测方法的敏感性相似,DNA最小检出量均为1×10-2 ng/μL;而以cox 1为靶基因的PCR检测方法敏感性相对较低,DNA的最低检出量为1 ng/μL。对7种不同寄生虫DNA进行特异性试验,结果以cox 1基因为靶基因的PCR方法特异性较好,仅能够扩增出枯氏住肉孢子虫(Sarcocystis cruzi)DNA;以18S rRNA为靶基因的PCR法,除枯氏住肉孢子虫外,刚地弓形虫和微小隐孢子虫也有相似扩增条带;以28S rRNA为靶基因的PCR法,除枯氏住肉孢子虫外,刚地弓形虫、微小隐孢子虫和欧猥迭宫绦虫DNA也能扩增出杂带,但大小不符。利用3种方法对100份牦牛和猪肉样品进行扩增,发现以18S rRNA、28S rRNA和cox 1为靶基因的PCR法的阳性率分别为36.00%(36/100)、43.00%(43/100)和38.00%(38/100)。结果表明,以cox 1为靶基因的PCR法有良好的特异性,适合用于田间动物肌肉样品中住肉孢子虫的检测,为开展动物住肉孢子虫病分子流行病学及防控研究提供了依据。