摘要：为快速检测并准确鉴别奶牛隐孢子虫种,以隐孢子虫18S rRNA基因的特殊区域为基础,设计内、外引物,并根据软件分析确定相应的内切酶EcoT14I,采用Nested PCR-RFLP方法进行虫种种型鉴别分析。在Nested PCR两次PCR反应中,以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.p)和安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,***)卵囊提取的DNA为模板,均能扩增出长约800bp和500bp的明亮条带,且特异性强,其他虫种不能扩增出条带,该方法最低可检测到5个卵囊/g粪便;对于由内引物扩增出的500bp的条带,***的PCR产物能被内切酶EcoT14I酶切,酶切后的片段分别为416bp和92bp,C.p的PCR产物不能被此酶酶切。用所建立的Nested PCR-RFLP法对上海奶牛389头和进口奶牛200头的共计589份粪样进行检测,Nested PCR的结果表明上海奶牛和进口奶牛的隐孢子虫阳性率分别为19.02%和3.5%,RFLP的结果表明上海奶牛感染的主要是C.p和***,进口奶牛感染的主要是C.p。研究结果表明,本研究建立的检测奶牛粪便中的隐孢子虫的Nested PCR-RFLP法,可用于奶牛隐孢子虫流行病学调查并有效鉴别奶牛隐孢子虫种。

摘要：链球菌蛋白G(streptococcal protein G,SPG)具有与多种动物IgG结合的特性。本研究对链球菌蛋白G进行生物学分析,设计重组蛋白G的基因序列,构建重组蛋白G的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,得到带有GST标签的融合蛋白,通过GST亲和层析纯化蛋白。Western blot结果显示,重组蛋白具备与IgG结合的能力。ELISA测定重组蛋白与牛、山羊、兔、鼠4个物种IgG的亲和力,显示重组蛋白G的亲和力普遍高于商品化链球菌蛋白G。本研究成功重构并表达、纯化了链球菌重组蛋白G,得到其与4个物种抗体IgG的亲和力常数,有助于SPG在其他相关研究中的应用。

摘要：根据丝氨酸蛋白酶保守性氨基酸序列设计引物,以镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA为模板,经PCR扩增得到SP30基因的保守区,通过5'RACE(rapid amplification of cDNA Ends)和3'RACE技术得到全长基因。将该基因连入原核表达载体pGEX-4T-1,经IPTG诱导纯化得到重组蛋白。以镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱各发育阶段的cDNA为模板进行Real-timePCR实验。结果显示,SP30基因全长1194 bp,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,预计蛋白分子质量30 kDa。Real-time PCR分析结果表明,该基因在四个不同的发育阶段均有不同程度的表达。

摘要：目的 构建日本血吸虫凝溶胶蛋白(Sjgelsolin)的原核表达载体,获得其表达产物并分析其在不同发育阶段的转录水平.方法 根据序列AY814387设计引物,体外扩增Sjgelsolin的蛋白质编码序列,将其插入pET28a(+)质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.提取日本血吸虫虫卵,尾蚴,7-d童虫,42-d雌、雄成虫的总RNA,用半定量RT-PCR分析Sj gelsolin在每个样本中的转录水平.结果 成功构建了pET28a(+)-Sjgelsolin重组质粒,并获得高水平的表达.Sjgelsolin转录子在尾蚴和雌虫成虫中未被检测到,而在7-d童虫和42-d雄虫成虫中被检测到.结论 Sjgelsolin在体外获得表达,且其转录是受发育调控的。

摘要：为克隆不同种隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因，分析其核苷酸与编码氨基酸序列的变异情况，根据GenBank上公布的微小隐孢子虫（C. parvum）Cryptopain-1基因序列设计合成引物，用PCR技术从不同种隐孢子虫基因组DNA中扩增Cryptopain-1基因，并将其克隆至pZeroBack/blunt载体，阳性克隆经PCR鉴定正确后测序，与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因进行序列同源性比对，并进行系统进化分析。结果显示，本研究成功从泰泽隐孢子虫（C. tyzzeri）、火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）、兔隐孢子虫（C. cuniculus）基因组DNA中扩增出Cryptopain-1基因。与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因比较，泰泽隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、兔隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分别为98.67%、94.53%、98.34%，演绎的氨基酸序列相似性分别为99.00%、96.51%、99.00%。研究结果为利用Cryptopain-1基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究奠定了基础。

摘要：根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。

摘要：目的建立快速诊断鼠脑心肌炎病毒感染的荧光定量RT-PCR方法。方法根据鼠脑心肌炎病毒(EMV)PEC9毒株全基因组序列(Gen Bank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果建立的荧光定量PCR方法,标准曲线的线性关系良好,r2值可达0.99,敏感性最低检测限为1个拷贝数,高于普通PCR方法 1000倍,其特异性强,与其他常见感染的小鼠病毒株均无特异性扩增,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠心肌样品进行检测,未检测到阳性感染。结论本研究为鼠脑心肌炎病毒感染的分子检测,为制定国家标准提供良好的方法。

摘要：根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。

摘要：本研究基于IS1081基因建立了鉴定犬结核的SYBRGreen荧光定量PCR方法。在最佳反应条件下反应效率为1．09，获得的标准曲线相关系数R值达0．9995，标准曲线的线性范围达到1～1×10^7拷贝8个数量级，最低可检测到约10个目的拷贝，即31．4fg DNA。根据溶解曲线分析，扩增产物中无引物二聚体的影响，说明所设计引物特异，退火温度合适。这表明本研究建立的SYBR Green荧光定量方法灵敏度高、定量范围广。利用该方法对临床样品进行检测，结果发现：与结核杆菌分离培养方法比较，符合率为85％。240份犬猫鼻拭子中150份被检测为阳性，这说明犬猫鼻腔中分枝杆菌携带率很高。

摘要：猪博卡病毒是最新发现的一种DNA病毒,于2009年首次在瑞典患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的猪体内被鉴定。为了及时地评估其在我国的流行情况,本研究根据GenBank上递交的唯一一条猪博卡病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,并首次建立了猪博卡病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好,对2009年我国部分省市猪场的191份临床样品进行检测,结果75份为猪博卡病毒阳性,这表明我国猪群中猪博卡病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以作为猪博卡病毒在临床上的一种诊断技术。