摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

摘要：为深入研究非洲猪瘟病毒（ASFV）DP71L蛋白的生物学功能，根据非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS/2018DP71L基因序列设计特异性引物，通过扩增DP71L基因并克隆到原核表达载体pET28a（+）后转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达，通过SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定，并以纯化出的重组DP71L蛋白免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体，间接ELISA测定多克隆抗体效价，Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示，重组DP71L蛋白以可溶物和包涵体两种形式表达；间接ELISA测得多克隆抗体血清效价为1∶64 000;Western-blot结果显示，该抗体能特异性识别DP71L蛋白。结论：成功地表达了DP71L重组蛋白，制备了多克隆抗体，为深入研究DP71L蛋白生物学功能奠定了基础。

摘要：建立基于酶促重组酶扩增（enzymatic recombinase amplification, ERA）技术的非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列，设计特异性的ERA探针和引物，经过反应条件的优化，建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示：建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应；CV均小于10%,具有良好的重复性；对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL-1;与世界动物卫生组织（WOAH）非洲猪瘟qPCR诊断方法对比，Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。

摘要：【目的】利用反向遗传操作技术,构建含O型口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)3个拓扑型免疫优势结构蛋白基因的重组FMDV,评估其作为猪O型口蹄疫(food-and-mouth disease,FMD)疫苗候选株的潜力。【方法】通过基因合成,在FMD疫苗株O/HN/CHA/93(古典中国拓扑型)的基因中嵌合流行株O/NXYCh/CHA/2018(东南亚拓扑型)VP1结构蛋白的重组病毒骨架上,用O/TUR/5/2009疫苗株(中东-南亚拓扑型)VP1蛋白的G-H环基因替换其对等基因,构建含O型3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组全长质粒,Not I线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救重组病毒。通过RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定重组病毒;噬斑试验和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。重组病毒制备疫苗免疫猪,用病毒中和试验分析其对当前流行的O型3个拓扑型FMDV的交叉反应性。【结果】成功拯救到含O型3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组病毒,重组病毒与亲本病毒具有相似的生物学特性。亲本病毒和重组病毒制备的疫苗免疫猪,均能够对中东-南亚型(Middle East-South Asia,ME-SA)拓扑型和东南亚型(South-East Asia,SEA)拓扑型病毒株产生保护性平均中和抗体(>1.65log10);均不能对古典中国型(Cathay)拓扑型流行株产生保护性平均中和抗体(<1.65log10),但与亲本病毒相比,O/TUR/5/2009疫苗株G-H环基因的替换显著提高了对ME-SA和SEA拓扑型病毒株的交叉反应性(P<0.05)。【结论】本研究对未来FMD疫苗的设计具有重要的指导意义。

摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15,PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA(small guide RNA,sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。

摘要：【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9)技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T)细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30(ubiquitin-specific protease 30,USP30)蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA(single guide RNAs,sgRNA),分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。

摘要：MGF360-9L是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重要的毒力基因,本实验室前期使用免疫共沉淀和液相色谱-质谱(IP-MS)联合技术,明确了MGF360-9L和宿主蛋白自噬/苄氯素1调节因子1(autophagy/beclin-1 regulator 1,Ambra 1)具有相互作用,现有的研究已经证实宿主蛋白Ambra 1在病原感染中发挥重要作用。为明确Ambra 1介导MGF360-9L对ASFV复制的调控作用及其机制,本研究构建Ambra 1真核表达质粒,使用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)技术,验证了Ambra 1和MGF360-9L的互作及互作区域。设计并合成Ambra 1的RNA干扰(RNAi)序列,运用实时荧光定量PCR(real-time q PCR,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)技术,证明了Ambra 1过表达抑制ASFV的复制,下调Ambra 1的表达则能够促进ASFV的复制。此外也证明了Ambra 1剂量依赖性降解MGF360-9L蛋白。总之,本研究明确了宿主蛋白Ambra 1介导ASFV MGF360-9L抑制其复制的初步机制。该研究丰富了ASFV蛋白与宿主蛋白之间的互作调控网络,为进一步研究ASFV-宿主相互作用积累了数据。

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLHL34基因敲除的猪肾细胞系(PK-15),初步探究KLHL34对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,为开展KLHL34功能研究和KLHL34调控病毒复制的分子机制提供试验材料。设计2条针对猪KLHL34基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别构建至载体PX459中;将PX459-KLHL34-sgRNA重组质粒转染PK-15细胞,经嘌呤霉素加压筛选、有限稀释法亚克隆挑取单克隆细胞,测序及Western-blot分析鉴定KLHL34基因的敲除情况。用FMDV感染鉴定后的KLHL34基因敲除细胞,利用间接免疫荧光试验、Western-blot、RT-qPCR和TCID50方法综合评价敲除KLHL34基因后对FMDV复制的影响。结果显示,敲除细胞中KLHL34基因发生了碱基缺失突变且引起了目的基因的移码,同时,敲除细胞中均未检测到KLHL34蛋白表达,表明成功构建了KLHL34基因敲除的PK-15细胞系;测定比较了FMDV在KLHL34基因敲除细胞系与对照细胞中的mRNA转录水平、病毒蛋白表达水平及病毒滴度,表明KLHL34基因敲除后显著促进了FMDV的复制。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了敲除KLHL34基因的PK-15细胞系,首次证实KLHL34在抗FMDV复制过程中发挥着重要作用,为后续研究KLHL34调控FMDV复制的机制奠定了基础。