摘要：VP1蛋白是口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV）诱导机体产生抗病毒感染免疫的主要蛋白,含有病毒的若干中和表位。本研究设计和合成了由AsiaI型FMDVVP1蛋白136~160aa和198~211aa两个表位组成的重复串联表位的编码基因,并克隆了羊IgG重链恒定区编码基因。利用BamHI、EcoRI和XhoI位点将2个基因片段依次克隆到pPROExHTb载体,构建成重组质粒pPRO-FshIgG,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以IPTG诱导表达得到融合蛋白FshIgG。100μgFshIgG蛋白免疫豚鼠后刺激豚鼠产生了高效价的FMDV中和抗体,而且使这些免疫豚鼠在用200ID50剂量FMDV攻击时得到了完全保护。由此证明,羊IgG重链恒定区蛋白能够作为FMDV表位肽的载体,而融合蛋白FshIgG可成为一种口蹄疫表位疫苗候选物用于口蹄疫的预防。

摘要：【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化复性后,制苗免疫猪。分别于免疫前和免疫后14和28d采血分离血清,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测血清IgG抗体滴度。免疫28d后用FMDV强毒攻毒,以评估免疫保护效果。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果证实A10、IA10和FA10三种蛋白均获得表达,分子量分别为35、57和64 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。LPB-ELISA结果表明,A10+201免疫组IgG滴度低于灭活疫苗组,但高于其他免疫组。攻毒后A10+201免疫组和灭活疫苗免疫组全部猪(5/5)获得保护,IA10+201和FA10+201免疫组80%(4/5)猪保护,A10和FA10免疫组只有20%(1/5)猪保护,而PBS+201组所有猪均未保护。【结论】A10+201免疫保护效果较好,可作为候选疫苗进行进一步评价。

摘要：用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。

摘要：为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。

摘要：为了获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)弱毒株的全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株(EF635006)和经典CH-1a株(AY032626)全基因组序列设计并合成特异引物,进而用RT-PCR分6段扩增了HP-PRRSV弱毒株的全基因组。将扩增的各个cDNA重叠片段分别克隆到pMD20-T载体中,建立了PRRSV弱毒株的初级cDNA克隆,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择特异的酶切位点,将各个亚克隆产物逐段亚克隆入经过改造的低拷贝pOK12载体中,通过引入MluⅠ和EcoRⅠ酶切位点将聚合酶Ⅱ、Ⅰ和T7启动子序列及榔头锤酶基因置于病毒基因组的5′端,引入NotⅠ和FseⅠ将聚合酶Ⅱ、Ⅰ终止子序列及戊型肝炎病毒核酶基因置于病毒基因组的3′端,结果得到了病毒基因组全长cDNA克隆ppAPRRSVOK12。测序结果表明,该毒株基因组全长15 319bp[不包括poly(A)尾];全基因序列比对结果显示,该毒株属于北美洲型毒株,与HuN4的同源性高达99.5%。测序及酶切鉴定结果证实,HP-PRRSV弱毒株基因组全长cDNA克隆已构建成功。

摘要：目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。

摘要：以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C。将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1。将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度。Western blot分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应。对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值。

摘要：提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmBⅠ/XmaⅠ、XmaⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/NotⅠ、HpaⅠ/KpnⅠ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠcDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pPⅠ-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定。结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾。其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段。将pPⅠFMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应。利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒。

摘要：根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中国代表株CH-1a的基因组序列，设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物，利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株（Lanzhou株）的ORF3和ORF5基因，并对其进行序列测定，同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较。将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上，将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBacHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞。结果显示，ORF3、ORF5基因长度分别为765bp、603bp，发现核苷酸的同源性分别为88.0％—99.2％、87.3％—99.0％，获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5。

摘要：随着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。