摘要：根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。

摘要：根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。

摘要：根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。

摘要：为从分子水平上阐明我国马梨形虫的种属分类特征。根据GenBank中登录的马梨形虫18SrRNA基因序列,在其高变区设计引物。PCR扩增获得大小分别为913bp、451bp的目的片段。将该片段克隆至pMD-18T载体后进行序列测定,并和GenBank上登录的其他地方株梨形虫18SrRNA基因序列进行同一性分析并构建系统发生树。分析显示,之前被称作马巴贝斯虫的虫种和泰勒虫虫种有着更密切的亲缘关系,在进化发育过程中处于同一种系,而与巴贝斯虫为明显的2个分支。我国驽巴贝斯虫肇源株与西班牙分离株(AY534883.1)仅有较小差异,其同源性高达91.8%。马泰勒虫肇源株与西班牙分离株(DQ287951.1,AY150064.2)同源性均高于91.4%。以上分析显示我国马梨形虫地方株和西班牙地方株亲缘关系最近,而与其他地方株差异相对较大。因此我国肇源株马梨形虫和西班牙地方株同属于Atbara8。

摘要：为揭示18SrRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026)18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计引物。将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析。系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远。序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变。而马巴贝斯虫和泰勒虫18SrRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大。以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18SrRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一。马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属。

摘要：为研究卵黄原蛋白(Vg)基因对蜱虫卵的生理机制作用,参考GenBank中微小扇头蜱(登录号:EU086096)卵黄原蛋白基因的核苷酸序列,设计特异性引物,PCR扩增血红扇头蜱相关基因,将其克隆至pGEM-T Easy载体,并测序。对获得的阳性克隆进行序列分析,选取Vg基因的VWFD功能区设计表达引物,构建重组表达载体pGEX-4T-1-Vg,并进行表达纯化。用Western-blot鉴定表达产物的免疫原性。结果显示,获得的1 218bp的核苷酸序列片段与预期结果一致。系统发生树显示,血红扇头蜱与微小扇头蜱具有较高的同源性,两者之间的同源性高达93%,其次与变异革蜱、希伯来花蜱、肩突硬蜱的同源性分别为85%、78%、62%。序列分析显示,该基因含有1个由221个氨基酸组成的VWFD功能区。该功能区重组融合蛋白的分子质量约为51ku。Western-blot分析表明,该重组蛋白与家兔抗血红扇头蜱全蜱阳性血清、家兔抗长角血蜱全蜱阳性血清、家兔抗残缘璃眼蜱全蜱阳性血清以及家兔抗草原革蜱全蜱阳性血清均出现不同程度的反应活性。结果表明,经表达Vg基因VWFD区域而制备的重组抗原对于不同蜱种血清具有广谱性。

摘要：为寻求一种快速、有效的马泰勒虫(Theileria equi,***)PCR检测方法。基于马泰勒虫18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。

摘要：根据驽巴贝斯虫(Babesia caballi)18S rRNA基因序列设计1对特异性引物,扩增出452 bp核苷酸片段,建立了检测驽巴贝斯虫病的PCR方法。敏感性试验结果表明,该方法最低能检出0.01 fg/μL驽巴贝斯虫DNA模板。特异性试验结果显示,在被检测的6个巴贝斯虫株中,仅驽巴贝斯虫株能扩增出特异性片段,马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫的扩增结果均为阴性。对45份马属动物血样进行检测,本研究建立的PCR方法测得驽巴贝斯虫病的阳性率为26.67%(12/45),与显微镜检测方法进行了比较,结果显示PCR检测方法可显著提高驽巴贝斯虫的检出率。

摘要：为了鉴定分离自甘肃永靖的1株双芽巴贝斯虫Hsp20基因型为一新基因型,参考双芽巴贝斯虫Hsp20核苷酸序列,设计特异性引物。对其进行扩增,利用生物信息学方法对其进行比对分析。结果显示,扩增获得了700 bp的核苷酸片段。与GenBank中公布的18种不同物种的氨基酸序列构建遗传发育树,结果表明本实验获得的双芽巴贝斯虫与美国株和中国新疆株的亲缘关系最近。对其氨基酸序列进行比对分析,发现在第31～85位点存在冗余,与公布的Hsp20氨基酸序列存在明显的差异。通过同源建模分析,发现该冗余致使Hsp20蛋白在第7号位形成1个环形结构,从而引起了第3号位的拉伸。通过生物信息学分析得出,获得的双芽巴贝斯虫甘肃株的Hsp20基因是一新基因型。该基因型的存在为更加准确诊断双芽巴贝斯虫病提供了依据。