摘要：【目的】克隆猪流产嗜性衣原体青海株主要外膜蛋白(Major outer membrane protein,MOMP)基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的猪流产嗜性衣原体MOMP基因的核苷酸序列,设计并合成4条特异性引物,用套式PCR方法扩增猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,将其克隆入pMD18-T载体中,进行测序及序列分析。然后将MOMP基因亚克隆入原核表达载体pGEX4T-1中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。【结果】扩增到猪流产嗜性衣原体青海株1170bp的MOMP全长基因。序列分析结果表明,该基因与已发表的猪流产嗜性衣原体B11001株和CP/12株核苷酸同源性均为99.7%。SDS-PAGE电泳可检测到分子质量约为66ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,重组蛋白可被猪流产嗜性衣原体抗体识别。【结论】成功克隆了猪流产嗜性衣原体青海株MOMP基因,并进行了原核表达,表达的蛋白具有抗原活性。

摘要：参照GenBank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物,从甘肃兰州疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,分段PCR扩增全长基因组。回收PCR产物,将其插入pGEM-T Easy载体,构建了重组质粒pGEM-PCV2,转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。结果表明,克隆到的PCV2全基因组长为1767 bp。应用DNAStar序列分析软件对所测PCV2序列与GenBank中登录的包括甘肃在内的国内外PCV2毒株进行同源性分析。结果显示,克隆的PCV2与ZhouKou(EU656143)毒株遗传关系较近,其核苷酸和推导的氨基酸序列同源性高达99.4%、98.6%,与已报道的GS03(EU547458)甘肃毒株遗传关系较远,可能是流行于甘肃兰州的一个变异毒株GSLZ(GenBank登录号为:FJ447482)。

摘要：设计1对特异性引物对羊布鲁菌16M总DNA进行外膜蛋白omp10的PCR扩增,得到了一个大小为330bp的目的基因片段(去掉17个氨基酸编码的信号肽),测序证实它与国外报道的羊布鲁菌omp10基因完全一致。将其克隆到表达载体PET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,该基因以包涵体的形式在大肠埃希菌中表达,经过包涵体的变性、复性和亲和层析纯化,成功获得大小为14.2ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Westernblot和间接ELISA试验证明,纯化之后的OMP10重组蛋白可以被布鲁菌阳性血清识别。

摘要：为了掌握小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白胞外区的功能,根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的H基因序列设计相应引物,分别克隆tH基因后构建原核表达载体pET-30a(+)-tH和真核表达载体pPIC9K-tH。将测序正确的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和酵母菌GS115,而后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,tH蛋白均获得了高效表达,融合蛋白的分子质量约为60ku,原核表达产物以包涵体的形式存在,其表达产量为4.68g/L,而目的蛋白的真核表达产量为0.5~1g/L。Western-blot分析表明,所表达的重组蛋白能被抗PPRV Nigeria 75/1株的阳性家兔血清特异性识别。结果表明,成功表达了小反刍兽疫病毒H基因胞外区,重组表达蛋白具有良好的反应原性,这为PPRV H蛋白与其受体相互作用功能区的确定奠定了基础。

摘要：目的构建弓形虫GJS株表面抗原1(SAG1)重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列(S76248)及其编码氨基酸序列的同源性分别为99%、97%;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。

摘要：以流产奶牛肝组织块内提取的基因组DNA为模板,根据GenBank数据库中的衣原体ompA基因序列设计2对引物,采用套式PCR进行扩增.PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后,进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:ompA基因的开放阅读框架全长1 170 bp,编码由389个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为41.9 ku,等电点为7.61;SMART分析表明,ompA基因编码的氨基酸中,1-22位氨基酸为信号肽序列,另外还有7个保守的半胱氨酸残基形成二硫键;BLAST同源性分析表明,ompA基因的核苷酸序列与已发表的衣原体ompA序列的同源性均达到了98%以上.

摘要：山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)是国内山羊新发病毒,本试验目的是建立检测CKoV的实时荧光定量PCR方法,并对西南三省腹泻山羊粪样进行该病毒的检测。选择CKoV最保守的3D基因序列,设计3D基因引物,初步设计实时荧光定量PCR,经优化反应条件和反应体系,成功建立了检测CKoV的TB Green染料法实时荧光定量PCR方法。该方法在病毒浓度2.23×10^(2)~2.23×108 copies·μL^(-1)范围内线性关系良好,相关系数为0.9992,扩增效率为110%;此方法具有良好的特异性和稳定性,最低检测限为2.23×10^(1) copies·μL^(-1)。采用所建立的方法对2020年1—4月采集自四川、云南和重庆的共15个场79份山羊腹泻粪样本进行检测,结果CKoV的平均检出率为25.3%,场阳性率为53.3%。并且本试验获得了13个完整的CKoV 3D基因,遗传进化分析表明这13个3D基因具有独特的进化趋势。本研究为CKoV的分子检测提供了一种新的技术手段和基础流行病学数据。

摘要：为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果,成功利用RACE获得Ddi1-like基因的全长cDNA序列;在真核表达系统中,绦虫上的Ddi1-like重组蛋白获得表达;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得重组蛋白即为Ddi1-like蛋白;免疫后获得抗血清,其效价达到1∶12 800。上述结果为后续研究Ddi1-like蛋白的酶切活性研究提供了基础。

摘要：为鉴定猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基基因(Ts PKA-C),分析其作为诊断抗原的可行性,利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计猪带绦虫Ts PKA-C特异引物,以猪带绦虫成虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增Ts PKA-C基因的完整ORF,并通过生物信息学分析进行鉴定。构建p ET-30a(+)-Ts PKA-C重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,Ts PKA-C的ORF由1 032个核苷酸组成,编码343个氨基酸残基,与细粒棘球蚴和多房棘球蚴氨基酸序列的一致性分别达78.7%和98.0%;Ts PKA-C具有蛋白激酶A的结构域及其催化亚基特征性活性位点,且存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。Ts PKA-C基因的表达产物主要以包涵体形式存在,且可与猪囊尾蚴病阳性血清发生反应,在42 ku处产生特异条带。本研究克隆并鉴定了Ts PKA-C基因,其表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。

摘要：绵羊源爱知病毒D型(ovine Aichivirus D)是在国内绵羊中新发现的病毒,本研究根据绵羊源Aichivirus D 3D基因序列设计检测引物,通过反应体系和条件优化,成功建立了检测绵羊源Aichivirus D的TB Green染料法荧光RT-PCR方法,该方法特异性和稳定性良好,灵敏度高。对2020年4月―2021年5月采集自四川6个场253份绵羊粪便样本(健康羊的133份,腹泻羊的120份)进行检测,结果该病毒的平均检出率为8.7%,场阳性率为66.7%。其中,腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(0.75%,P<0.001)。表明绵羊源Aichivirus D可能是引起以上地区绵羊腹泻的病原。从绵羊源Aichivirus D的阳性样本中成功克隆出大小为1422 bp的13个完整的绵羊源Aichivirus D 3D基因,其核苷酸相似性为99.4%~100.0%。遗传演化分析发现这13株绵羊源Aichivirus D 3D基因与本实验室前期研究上传的绵羊源Aichivirus D 3D基因共同聚为单独的一个大支。本研究为绵羊源Aichivirus D的分子检测提供了一种新的方法和基础流行病学数据。