摘要：旋毛虫肌幼虫排泄－分泌（ＥＳ）抗原来源于体外培养的旋毛虫肌幼虫的排泄－分泌物。为研制具有ＥＳ抗原功能的旋毛虫基因重组抗原，首先用ＡＧＰＣ法提取旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ并进行变性琼脂糖凝胶电泳分析，发现它缺少真核生物所具有的２８ＳｒＲＮＡ。根据编码４５０００和４９０００蛋白的基因结构，设计并合成２对ＰＣＲ引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增出了２个目的基因（ＴＳＰＧ和ＴＳＰＧⅡ）。序列分析发现，ＴＳＰＧ在第４５８到５０５位之间的核苷酸编码框架与结构基因Ｐ４５的不同，此外，还有多处出现与Ｐ４５不同的碱基。在ＴＳＰＧⅡ核苷酸序列中只有１个碱基与Ｐ４９不同。根据可识别的糖基化位点判定，ＴＳＰＧ和ＴＳＰＧⅡ各含有１个Ｎ－型连接的糖基化位点。将构建的３个重组质粒转化大肠杆菌，通过温度诱导培养，分别在大肠杆菌中表达出３７０００、４６０００和３４０００的重组蛋白，三者的表达水平分别为２２％、１０％和８％；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和ＥＬＩＳＡ检测表明，它们均可被猪旋毛虫病阳性血清和单克隆抗体识别，但特异性有所不同。将ＴＳＰＧⅡ克隆至Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｙｅａｓｔ穿梭载体ｐＨＩＬ－Ｓ１上，经内切酶消化和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定后，?

摘要：【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus typeⅢ,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436 bp)、PCV3 Cap基因(619 bp)和SIV M基因(199 bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus typeⅡ,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirusⅡ,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirusⅢ,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。

摘要：根据siRNA设计原则,设计并合成5对靶向禽流感病毒(AIV)PB2基因的siRNA(PB2374,PB2665,PB2936,PB21031和PB21233),将其转染MDCK细胞,分别于转染前和转染后感染H5N1禽流感病毒A/Goose/Guang dong1/96株;在转染后24h、48h和72h分别收集上清液;通过血凝试验(HA)和Real-time PCR检测siRNA抑制AIV增殖的效果。血凝试验结果表明:所设计的5对siRNA中,PB2374抑制AIV增殖的效率为68%～71%,PB2963抑制AIV增殖效率为78%～81%;Real-time PCR检测到PB2374转染组PB2基因的转录水平与对照组比较降低3～3.3倍,PB2963转染组PB2基因的转录水平降低3.9～4.2倍。无论siRNA是先于还是迟于AIV感染,这两对siRNA都能明显地抑制AIV的增殖;本研究结果为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。

摘要：为构建猪捷申病毒(Porcine testhovirus,PTV)感染性克隆,进行病毒基因组结构、功能及新型疫苗研究,根据NCBI发表的PTV Swine/CH/IMH/03株及Talfan株核苷酸序列,设计并合成了4对特异性引物,PCR扩增并克隆覆盖PTV Swine/CH/IMH/03全长基因组的4个片段。经过反复拼接和测序,最终将PTV全长cDNA定向克隆到pBluescript SK(+)中。PCR、双酶切及测序鉴定证明PTV全长cDNA克隆构建成功。与Swine/CH/IMH/03亲本株及NCBI登录的其他PTV毒株序列比对发现,该克隆只有3个位点存在核苷酸及氨基酸突变,分别位于2A、2C及3D中。

摘要：根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。

摘要：根据已发表的传染性喉气管炎病毒 ( ILTV) SA-2株的核酸序列 ,设计了 1对引物 ,以 ILTV中国王岗株 DNA为模板 ,PCR法扩增出 1条 1 .3 9kb的基因片段 ,将扩增产物插入到真核表达质粒 p CRTM 3 -Uni,得到重组质粒 p TA-g D。另将克隆到 p Bluescript SK质粒中的 g C基因酶切后 ,插入到 p CRTM 3 -Uni载体 ,得到重组质粒 p TA-g C。经电泳分析、酶切、PCR鉴定后 ,进行序列测定。序列分析表明 ,ILTV王岗株 g C基因的编码序列与 SA-2株的核苷酸同一性为 99%,而王岗株 g D基因的编码序列在其 C端多了 1 7个核苷酸 ,其余部分的同一性为 97%。鉴于 g C、g D基因在诱导机体产生对 ILTV的免疫应答中的作用 ,g C、g D基因的克隆及其真核表达质粒的构建 ,为

摘要：根据鸡胚致死孤儿(CELO)病毒Phelps株的fiber1基因(GenBank序列号U46933)序列设计了1对引物,采用PCR扩增CELO病毒fiber1基因C端(包含Knobs区)的部分片段,并将其克隆到质粒表达载体pGEX6p1,获得的阳性克隆命名为pGEXAF807。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列与CELO病毒Phelps株的fiber1基因序列完全一致。将pGEXAF807转化大肠埃希氏菌DH5α,经37℃、0.6mmol/LIPTG诱导表达5h,SDSPAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.6ku,目的蛋白量占菌体总蛋白的35.7%。用CELO病毒多克隆血清做Westernblotting试验,结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。

摘要：本实验根据已经发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)M蛋白基因序列设计并合成一对引物 ,利用RT_PCR扩增得到了IBV新疆分离株LX4株 (HA价为 2 7)M基因 678bp的片段 ,将该片段克隆到PUC18载体上 ,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒。采用Sanger’s双脱氧末端终止法对插入片段进行核苷酸序列测定 ,获得了IBV_LX4株M基因的核苷酸序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将它与GENBANK中发表的 15株国外参考毒株相比较 ,发现核苷酸的同源性 (除D14 66和DE0 72外 )为 85 % ～92 % ,氨基酸的同源性为 83 % ～92 % ,与国内参考株 (H5 2_GD)相比分别为 90 %和 92 % ,确证我们得到的克隆片段为IBV -LX4株的M基因。且含有两个糖基化位点 ,9个高度保守的半胱氨酸 ,三个跨膜区域 。

摘要：利用DNASIS等软件分析传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株的gB蛋白抗原性,筛选出一段抗原性较强的片段,该片段位于gB蛋白的403位至686位氨基酸残基之间。设计引物,引入双酶切位点EcoRⅠ,SalⅠ,将目的片段t-gB插入原核表达载体pET30a(+),得到重组表达质粒pET-tgB并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,表达分子量为37Ku的融合蛋白His-tgB,表达量占菌体蛋白的40.6%。Westernblot分析表明,His-tgB具有免疫反应性。重组蛋白免疫兔之后可以产生针对ILTVgB的特异性抗体。

摘要：为加强对猪源伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）的监测,在PRV gB基因的保守区设计特异性引物,并建立了检测猪源PRV的实时定量PCR。该方法可检测PRV的最低TCID50为2×10^1/mL,比伪狂犬病诊断技术国家标准中的PCR方法敏感100-1 000倍,且特异性、重复性好。利用该方法测定了PRV SC株在感染Vero细胞后的复制动态;结果显示,PRV在感染后第12小时进入复制高峰期,在感染后第24小时达到平台期。本方法具有快速、敏感和重复性好等特点,能够为研究病毒的复制动态或临床样品的检测提供技术支持。