摘要：将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV、IBV的保守基因片段作为探针，同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照，利用芯片点样系统spotArray TM24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上，制备了AIV等RNA病毒诊断芯片，并从点样条件和杂交条件两个方面进行了优化。结果显示，探针浓度在300～1200μg／mL时点样，Cy3-dUTP终浓度为0．05μmol／mL，杂交温度在42℃，杂交时间在8～12h时，杂交信号比较理想。该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100％（20／20）；10份现地送检的疑似AIV样品的检出率为70％（7／10），检测结果与RT—PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100％。结果表明，制备的DNA芯片可有效诊断上述病毒。

摘要：根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。

摘要：根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

摘要：通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^4.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×10^2.5EID50/mL。用该方法检测H1-H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。

摘要：根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP)。SDS-PAGE分析、Western-blotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性。

摘要：本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT＿PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18＿T载体上,并进行鉴定和序列测定。测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致。根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基。与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列。

摘要：根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。

摘要：为建立快速检测甲型H1N1流感病毒[Influenza A(H1N1)pdm09]的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因保守序列,设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,采用实时荧光定量PCR技术检测甲型H1N1流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-HA标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,敏感性可达50 TCID50。本研究中,甲型H1N1流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法与经典H1N1、类禽H1N1、类人H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒无交叉反应。结果表明,该方法可以在人类和动物间有效地检测甲型H1N1流感病毒。

摘要：为建立检测禽流感病毒(AIV)的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞,收集感染6、12、24、48、72 h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测,试图建立快速检测AIV的SYBR Green I荧光RT-PCR方法,并与普通RT-PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明:此次建立的检测AIV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72 h的AIV,对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5.33%(9/169),而普通RT-PCR方法检出率为6.51%(11/169),病毒滴定检出率为5.62(9/160)。对其他病毒(NDVI、BDVI、BV、VA)则未检测到,且整个检测过程只需4 h,表明该方法特异、准确、快速。

摘要：根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。