摘要：苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

摘要：用蝇蛆匀浆液、全脂蝇蛆粉、脱脂蝇蛆粉、酵母粉、猪肝分别作为主成分,添加生鸡蛋黄、蔗糖等配成大草蛉幼虫的人工饲料,从二龄开始饲养,以幼虫存活率、羽化率等作为评价指标,通过比较得出,含蝇蛆蛋白饲料饲养效果优于酵母粉和猪肝。3种蝇蛆蛋白饲料中,含脱脂蝇蛆粉的配方实用效果最佳,幼虫存活率达96%,羽化率达58.3%。采用均匀设计法优化饲料配方,用SAS软件进行回归分析,得到饲料中4个主要成分的最佳配比:猪肝2.0g、脱脂蝇蛆粉2.3g、蔗糖0.3g、鸡蛋黄1.7g。

摘要：本研究通过对多个小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）小麦分离物进行序列分析,在编码Rep蛋白N端的基因保守区域设计一对特异性引物和一条长度为19 bp的TaqMan LNA探针,经过探针和引物浓度的系列优化,建立了WDV田间样品LNA探针实时荧光定量PCR检测方法,确定最优反应条件下的引物和探针终浓度分别为0.5μmol/L和0.3μmol/L。该方法建立的标准曲线斜率及相关系数分别为-3.424 3和0.997 3,扩增效率为96.0%,重复性试验组内变异系数为0.11%-1.34%,组间变异系数为0.44%-1.21%,最低检测限为55 copies/μL,其灵敏度是普通PCR的100倍以上。与普通TaqMan探针荧光定量PCR相比,该方法所用探针长度大大缩短,减少了探针间形成二级结构的机会,探针设计更加简单、方便。该方法适用于田间样品的早期监测,为病害流行调查提供了高效快捷的技术支撑。

摘要：为了建立重要植病生防真菌粉红粘帚霉67-1菌株的荧光定量PCR检测方法,收集了目标菌株、粘帚霉属其它多个种及近缘木霉属的多个种等共18个菌株,并进行了ITS区测序。以200bp左右差异较大区段设计出探针和引物。该引物及探针能有效扩增目标菌株,而其它17株非目标菌株没有扩增,表明所设计的引物和探针具有高度特异性。以目标菌株的阳性克隆质粒作为标准物质,建立了标准曲线,相关系数为0.9989,且扩增效率较高(95.0%)。经过土壤样品试验,得出标准曲线相关系数为0.9979,表明所建立的粘帚霉67-1菌株荧光定量PCR检测方法合理有效、快速实用,适合生态学研究的要求。

摘要：根据所有已知 G 蛋白β亚基的保守区设计简并性寡核苷酸引物,通过3′-和5′-RACE方法结合 RT-PCR 技术,从麦长管蚜中分离全长 cDNA 序列,并用半定量 RT-PCR 的方法研究基因在不同组织的转录水平。克隆的β亚基序列全长1336 bp,编码区1023 bp,编码340个aa,推测的分子量为37.27 kDa,等电点为5.56。GenBank BLAST 结果表明,β亚基与冈比亚蚊 Anopheles gambiae 的氨基酸序列同源性最高,为93%,与果蝇 Drosophila melanogaster β_1的同源性为90%,与线虫 Caenorhabditis efegans 的同源性为85%,与哺乳动物β_2的同源性为80%。该亚基在麦蚜头、胸和腹部都能表达,但在头部的表达量最高,推测该种类型的β亚基可能参与多种信号传导途径的调控。该基因首次从麦蚜中克隆到,命名为 SavGβ,在 GenBank中的登录号为 AY205294。

摘要：本文通过使用USER酶克隆技术,构建一系列用于镰刀菌基因敲除和荧光融合蛋白表达,并且操作简单快速的通用载体。在hph基因两侧引入USER酶特异位点,构建了基因敲除载体pKH-KO,可以一步在hph的两侧同时插入上下游同源重组片段;在gfp基因5′端引入USER位点构建了荧光融合蛋白表达载体pKHGFPE和pKNGFPE。此方法构建的载体在插入目的片段时均不用考虑酶切位点,极大地方便了试验设计,并且步骤简单,操作简便,节约大量时间。在大规模进行基因敲除以及相关蛋白定位等基因功能研究上具有广阔的应用前景。

摘要：为建立葡萄根瘤蚜实时荧光定量PCR的检测方法,参考Karen Herbert等设计的特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,构建以标准阳性质粒作为标准品制作标准曲线,并经优化反应条件,建立葡萄根瘤蚜的实时荧光PCR绝对定量检测方法,进行敏感性和重复性试验,并对受葡萄根瘤蚜为害的葡萄根际土壤进行初步定性检测。结果表明:该方法的灵敏度可达1.625拷贝/μL,3次重复检测的变异系数均小于5%。提取0.25g含有10头葡萄根瘤蚜若虫土壤的DNA,并将其梯度稀释,用建立的荧光定量PCR进行检测,将DNA稀释103倍后,仍能检测出阳性结果。对受害葡萄根际土壤检测结果为阳性。葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。

摘要：许多抗病基因都具有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR类抗病基因的保守序列,分别设计一对简并引物和一对特异引物,用以扩增棉花基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500bp的扩增片段,克隆测序后得到10条NBS-LRR类RGAs。推导的氨基酸均具有抗病基因的P-loop(kinase-1a)、kinase-2、kinase-3a及GLPL区。同源性比较发现,其中1条属于TIR-NBS-LRR类,其余9条属于non-TIR-NBS-LRR类。1条TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的N、L6、M等抗病基因的同源性为51%～60%,9条non-TIR-NBS-LRR类RGAs与已克隆的RPS5、RPR1、Xa1等抗病基因的同源性为51%～60%。这些抗病基因同源序列(RGAs)可作为分子标记筛选棉花的抗病候选基因。

摘要：异沙叶蝉可传播小麦矮缩病毒Wheat dwarf virus(WDV)和小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus(WYSV)两种病毒。本文根据WDV和WYSV的基因序列分别设计两种病毒的特异性引物对,以含有上述两种病毒的异沙叶蝉样品总RNA为模板,以随机引物为3′端通用引物反转录获得cDNA,然后在同一个PCR反应体系加入两对引物,分别得到与预期相符的773 bp和322 bp扩增产物条带。通过对引物浓度、dNTP和rTaq用量以及退火温度等条件进行优化,建立了能在同一异沙叶蝉体内检测WDV与WYSV两种小麦病毒的双重RT-PCR方法。该双重PCR方法特异性强、敏感性高,可以快速准确地在一个体系里同步检测介体昆虫体内的两种病毒,有效地检测虫体内病毒带毒率,这些结果可为病毒预测预报和病害防治提供参考。

摘要：以菌株液体发酵过程中菌丝干重和芽生孢子浓度为测试指标,对球孢白僵菌DZDC-9菌株液体发酵营养需求进行优化,结果表明,菌株生长的适宜碳源为葡萄糖,适宜氮源为酵母粉,在基础培养液中添加0.000 5 mol/L KCl可以显著提高菌丝和芽生孢子浓度。通过单因素分析和正交设计对不同培养条件下菌丝生长量进行测定,结果表明,在培养温度26℃,培养液装样量1/5,初始接菌量107个/mL,转速200r/min的培养条件下,菌株液体发酵能在60h达到最大菌丝生长量(13.184±0.328 6)g/L。利用筛选出的培养基和培养条件进行液固双相发酵试验,得到的孢子粉产量为(22.30±1.78)g/kg大米,显著高于优化之前的产量(13.04±1.90)g/kg大米。