摘要：为设计一种能够响应pH的、新型多功能创面敷料,使用季铵化壳聚糖(QCS)、接枝了磺胺嘧啶(SD)的氧化葡聚糖(Dex-CHO/SD)和妥布霉素(TOB),通过席夫碱键和氢键反应形成DSTQ水凝胶。对水凝胶的形貌、降解性、抑菌性、细胞相容性、血液相容性等性能进行研究。结果表明:具有三维孔状结构的DSTQ水凝胶可以响应感染造成的pH降低,进而发生降解,释放药物;DSTQ水凝胶对铜绿假单胞菌的抑制率显著高于金黄色葡萄球菌;DSTQ水凝胶毒性低,生物安全性高,与L929细胞共培养3 d后,细胞活力高于95%;DSTQ水凝胶具有良好的血液相容性,溶血率远小于5%;细胞在DSTQ水凝胶表面能够快速迁移,有利于伤口愈合;当DSTQ水凝胶负载生长因子后具有良好的抗炎效果。研究结果表明,DSTQ水凝胶可以作为新型创面敷料,有望应用于临床促伤口愈合。

摘要：为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)体外诱导表达的MGF360-13L蛋白,试验依据GenBank中报道的MGF360-13L基因序列设计引物,引入His标签,以ASFV全序列为模板扩增目的片段。将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中进行体外诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质的表达情况,将表达的重组蛋白通过镍琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化,蛋白质印迹(Western-blot)分析蛋白质的活性。结果表明:克隆得到的MGF360-13L基因片段长度为1060 bp,获得的重组蛋白在沉淀中以包涵体的形式表达,分子质量约为60 ku,纯化后可获得纯度较高的MGF360-13L,用BCA法测定最高浓度为2.73 mg/mL。Western-blot检测结果显示在60 ku处有一条明显的特异性条带说明MGF360-13L蛋白可以在BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中表达并纯化,纯化后可获得纯度较高的MGF360-13L,且具有良好的反应原性。

摘要：【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0~14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0~7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1000、1∶2000倍比稀释后均能特异性识别转染pcDNA3.1-PDR-Strep的Expi293F表达的PDCoV RBD蛋白、杆状病毒感染SF9细胞表达的PDCoV RBD蛋白,1∶1000稀释后能够检测到PDCoV感染ST细胞表达的PDCoV S蛋白,而在TGEV和PEDV感染的细胞中未检测到特异性蛋白的表达;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价可以达到1∶12800。【结论】利用生物信息学技术成功预测PDCoV RBD蛋白抗原表位,免疫后获得的抗体具有较好的特异性。

摘要：光谱技术在生物和医学检测方面具有积极的应用前景。由于血液成分的复杂性和类同性,有关不同动物血液光谱识别分类的技术研究尚未出现较为完善的结论。基于机器学习理论,以BP神经网络为工具,建立了对不同动物血液荧光光谱进行特征提取和识别分类的方法。实验采用Cary Eclipse光谱仪分别采集了鸽、鸡、鼠、羊四种动物不同浓度(1%和3%)的全血与红细胞荧光光谱数据(每个类型样本各50组数据);基于移动平滑算法对原始数据进行了平滑处理,以减少实验仪器噪声对特征提取和识别分类的影响;进一步根据血液光谱数据的特性,该文出了"组合放大"的特征提取方法,并建立了BP神经网络分类器进行训练和识别。相比于常用的光谱数据(单一)特征,提出的"组合放大"特征和所设计的BP神经网络能对不同动物、不同类型(全血与红细胞)、不同浓度(1%和3%)的血液荧光光谱实现100%的准确分类,同时神经网络测试误差均远小于设定的允许误差值。研究的动物血液光谱特征提取及识别技术具有较好的普适性和可靠性,在农业、食品检查、以及生物医学检测等方面均可发挥重要作用。

摘要：目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。

摘要：目的:构建MyD88基因缺失的RAW264.7细胞株,为探寻MyD88基因的作用提供重要载体。方法:制备HBLV-Cas9-PURO慢病毒,感染RAW264.7细胞,得到RAW264.7-Cas9细胞株。依据CRISPR/Cas9系统原理,设计3条靶向MyD88基因的sgRNA,慢病毒包装后感染RAW264.7-Cas9细胞株,观察感染效果,PCR和Western blot验证MyD88基因敲除水平并筛选稳转细胞株。选取敲除效果最佳株,经LPS和PGN诱导后,荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达和分泌。结果:HBLV-Cas9-PURO感染后RAW264.7细胞Cas9基因扩增明显升高,RAW264.7-Cas9细胞株构建成功。包装目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9后,荧光显微镜观察导入成功;PCR显示与对照组相比,HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88基因表达显著下调;Western blot进一步证实,HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88蛋白表达下降,且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著。LPS和PGN诱导HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组细胞后,TNF-α表达和分泌水平均下调。结论:利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术成功构建稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株。

摘要：狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus, RABV)引起的一种严重人畜共患的急性接触性传染病,其致死率为100%,每年全球约6万人死于该病,其中亚洲和非洲发生最多。RABV是狂犬病的致病病原体,由结构蛋白和负链RNA构成。狂犬病一旦发病致死率为100%,目前疫苗接种仍是预防和控制狂犬病最为有效的策略。RNA疫苗是新一代核酸疫苗,其安全性好,有效性高,设计灵活,研发周期短,且借助高效递送系统,可刺激机体快速产生强烈免疫应答。RNA疫苗这一特点对于潜伏期短且病死率高的狂犬病的防控具有重要应用价值。现对RNA疫苗及狂犬病RNA疫苗的研究进行系统梳理,以阐明其研究现状及应用前景。

摘要：通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞,然后进行嘌呤霉素加压筛选,利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定,鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞,通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明,在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失,细胞中IFITM3蛋白表达消失,但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞,表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了基于肠道细胞敲除IFITM3基因的Caco2单细胞克隆,验证了IFITM3敲除对细胞抗VSV感染的影响,为进一步深入研究IFITM3与肠道病毒的互作及其功能奠定基础。

摘要：研发的多功能自动转运系统可完成在实验室有限空间内,大重量物体的跨房间转运。设备最大荷载1000 kg,装卸转移全流程实现自动化,具备主动避障、自动充电功等智能化功能,并在承载面设计了动物解剖台工结构,解决目前生物安全实验室重物转运过程中存在的痛点问题。

摘要：目的利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△TK-RBDEPI具备良好的免疫原性。结论获得能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒,该疫苗具有免疫原性,为以痘苗病毒为载体的SARS-CoV-2疫苗的进一步研究和临床治疗奠定了基础。