摘要：为了获得具有天然构象且反应原性良好的猪δ冠状病毒((PDCoV))受体结合域(RBD)蛋白,根据PDCoV流行株CC-HN2K-02株S蛋白编码序列,筛选、设计、优化并合成其RBD段DNA序列,将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBac^(TM) Dual上,获得pFBD-PDR重组质粒。将该重组质粒转化到DH10Bac^(TM)大肠杆菌感受态细胞中,进行2轮蓝白斑筛选并进行PCR鉴定获得阳性重组杆状质粒Bacmid-PDR;通过脂质体转染SF9细胞进行病毒拯救,出现明显病变后收取上清,并在正常SF9细胞中盲传3代,获得的杆状病毒命名为rBV-PDR。利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测rBV-PDR感染昆虫细胞后的蛋白表达情况。结果:重组质粒pFBD-PDR酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PDR构建成功,杆状病毒中能够表达PDR蛋白且能与Sterp-tag抗体发生特异性结合,IFA鉴定出特异性红色荧光,表明本试验成功表达了PDCoV-RBD蛋白,为深入开展PDCoV抗体的制备、新型疫苗、诊断试剂研发奠定了基础。

摘要：受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(GenBank登录号:AKN45969.1),设计、优化并合成其RBD部分基因序列,并将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual上,得到了重组质粒pFBD-PER。将pFBD-PER转化到大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid-PER,通过脂质体转染至Sf9细胞中进行病毒拯救。转染120 h后,收取上清病毒液,盲传3代后收取Sf9细胞,利用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot确定PEDV-RBD蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-PER酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PER成功构建,杆状病毒能够表达PEDV-RBD蛋白,且能与strep tag抗体发生特异性反应。IFA鉴定出现特异性绿色荧光。结果表明,成功表达了PEDV-RBD蛋白且具有反应原性,为深入开展PEDV抗体制备、新型疫苗研发奠定基础。