摘要：根据GenBank中的中国兔出血症病毒(RHDV)分离株VP60基因保守序列设计合成了内、外2对引物,在Bst DNA聚合酶的作用下完成等温核酸扩增反应,对反应条件逐一优化,并对临床样品进行检测。结果表明,该方法简便、快速、特异性好,灵敏性较常规反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)高100倍。该方法可同时扩增7株RHDV中国分离株,说明其对检测国内RHDV分离株的有效性。对15份临床样品的检测结果显示,环介导等温扩增(LAMP)阳性检出率达80%,RT-PCR检测阳性率为60%。该LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便快速、不需要复杂仪器设备、便于肉眼观察等优点,可作为临床检测RHDV的新方法,适合国内基层和实验室对RHDV的快速检测,具有广泛的推广应用价值。

摘要：为掌握鸭疫里氏杆菌Riean1110基因表达产物的免疫原性,根据GenBank上公布的鸭疫里氏杆菌DSM15868株(登录号为NC014738)的基因序列设计1对特异性引物,扩增了血清1型鸭疫里氏杆菌HLG1株的Riean1110基因。将其克隆到表达载体pPRO-EX-Htb中,构建重组表达质粒pHtb-RA1110,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的目的蛋白的分子质量大约为56ku,与预期大小相符,以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,诱导的重组蛋白能特异性地识别鸭疫里氏杆菌阳性血清,具有良好的抗原性。用纯化的Riean1110蛋白免疫SPF鸭,经ELISA检测,可产生高水平的抗体。结果表明,制备的重组Riean1110蛋白为建立鸭疫里氏杆菌的血清学检测方法奠定了基础。

摘要：为了研究多杀性巴氏杆菌(***,Pm)热休克蛋白60(Hsp60)基因表达产物的抗原性,试验根据已发表的Pm 70株序列(AE004439)设计了1对引物,采用PCR技术扩增了兔多杀性巴氏杆菌C51-17株Hsp60的基因序列,将扩增产物与表达载体pPRO-EX-htb连接,得到重组表达质粒pHT-Hsp60,再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并测序确认正确后,将重组表达质粒pHT-Hsp60转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明:SDS-PAGE表达蛋白约为60 ku,与预期的Hsp60分子质量一致;表达产物与兔多杀性巴氏杆菌阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的抗原性。

摘要：为了建立针对鸭疫里氏杆菌的病原学检测方法,试验根据已发表的鸭疫里氏杆菌的外膜蛋白A(OmpA)的基因序列(GenBank登录号为AF104937)设计1对引物,对7株不同血清型鸭疫里氏杆菌进行扩增并建立PCR方法。结果表明:均扩增出与预计大小一致的目的片段,PCR方法敏感性可达到8.6 pg;而多杀性巴氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌和金色葡萄球菌均未扩增出预计大小的片段,说明该PCR方法具有良好的特异性。同时用建立的PCR方法对鸭疫里氏杆菌攻毒鸭病例和临床疑似病鸭的脏器分离菌进行扩增,均可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。

摘要：为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据Gen Bank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条Taq Man探针,将2B基因克隆到p Blue Script SK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3%。本研究建立的FMDV Taq Man荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义。

摘要：根据已发表的Pm70株的序列(GenBank登录号:AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌标准株C48-102的外膜蛋白基因A(ompA),扩增的片段为1062bp。将测序结果与GenBank中多杀性巴氏杆菌P52、PM70、T931317、T94289的ompA序列比对结果表明,核苷酸水平上同源性为89.0%～98.9%;在氨基酸水平上同源性为90.7%～99.2%。全ompA序列在大肠杆菌中干扰蛋白的正常表达,因此截断ompA蛋白的信号肽序列,将去信号肽的ompA基因插入到pPRO-EX-Htb载体上,构建了原核表达载体Htb-ompA,转化BL21,并诱导表达,SDS-PAGE结果表明,表达蛋白约为35kDa,与预期的分子量大小相符。Western-blot结果表明,表达的蛋白具有良好的抗原活性。本研究重组蛋白ompA的获得,为敲除ompA基因多杀性巴氏杆菌突变株的血清学检测奠定基础。