摘要：背景:目前对于脂肪间充质干细胞端粒酶的表达尚无统一定论。目的:探讨不同供者来源和不同传代次数的成人脂肪间充质干细胞是否表达端粒酶活性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2009-08在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成。材料:成人脂肪组织来源于天津怡丽医学美容整形门诊接受抽脂术的5例健康供者,Hela细胞由中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心提供。方法:分别从每例健康供者抽取20mL脂肪组织,胶原酶消化法体外分离培养人脂肪间充质干细胞,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。以Hela细胞作为对照,加入含体积分数为10%胎牛血清的1640培养基,待细胞生长至80%融合时胰酶消化传代。主要观察指标:人脂肪间充质干细胞的形态、表型、分化潜能,RT-PCR法检测人脂肪间充质干细胞端粒酶基因的表达,TRAP-ELISA法检测人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性。结果:实验分离得到的人脂肪间充质干细胞呈贴壁生长,显微镜下呈梭形,当细胞密度较大时表现出漩涡状生长;CD19,CD34,CD11b,CD45,HLA-DR呈阴性表达,CD73,CD90,CD105呈阳性表达;成脂诱导后油红O染色可见明显红色油滴,成骨诱导后VonKossa染色可见黑色颗粒,提示有钙沉积。P1,P4,P7代人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶反转录酶基因,5例不同供者来源的脂肪间充质干细胞亦均不表达端粒酶反转录酶基因。Hela细胞具有端粒酶活性,人脂肪间充质干细胞不表达端粒酶活性。结论:不同供者来源和不同传代次数的人脂肪间充质干细胞均不表达端粒酶mRNA,也无端粒酶活性。

摘要：背景:由于大量获取骨髓细胞存在困难,并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降,因此需要寻找其他间充质干细胞来源。目的:优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件,进一步明确其生物学特性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-09/2008-03在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。材料:17份脐带标本取自健康足月新生儿,由天津市中心妇产医院提供。方法:脐带采集后在6h内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养,于培养第14天计数集落数,超过50个细胞计为集落。当细胞达70%～80%融合时,胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化,以(2.5～5.0)×103/cm2密度传代培养。主要观察指标:比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率,应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表型,特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。结果:植块法培养6～10d可见成纤维样细胞从植块边缘爬出,形态与骨髓间充质干细胞相似,散在分布或形成小克隆,原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁细胞/0.5cm脐带组织,至少可稳定传15代,平均每代扩增6.2倍,在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P<0.05);而胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细胞。人脐带间充质干细胞的倍增时间为45h,72.09%细胞处于G0/G1期,不表达造血细胞及内皮细胞标记,高表达整合素和黏附分子CD44,CD90,CD95以及CD73,CD105,在特定诱导条件下,人脐带间充质干细胞能够向成骨及成脂肪细胞方向分化。结论:应用植块法可以从人脐带组织中简便高效地分离出一群具有高增殖活性及多向分化潜能的间充质干细胞,其免疫表型类似于骨髓间充质干细胞。

摘要：目的:研究急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿应用大剂量甲氨蝶呤(MTX)化疗期间,MTX血药浓度与不良反应的关系,从而设定合理的MTX解救方案。方法:133例ALL标危患儿连续静脉滴注MTX 24 h后,监测48 h时MTX血药浓度(c48 h),并观察毒副作用。结果和结论:MTXc48 h≤0.1μmol/L是一个比较安全的浓度范围,在充分水化、碱化的同时,在MTXc48 h为0.3μmol/L左右时停止解救,在临床上仍然是安全的。

摘要：目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)结合Cas12a检测输血相关病原体的可行性。方法 1)根据输血相关病原体HIV、HBV、HCV基因组保守区设计、筛选相应Cas12a crRNA。2)据crRNA靶序列区叠瓦状设计RPA巢式扩增内、外侧引物,凝胶电泳法和荧光探针法筛选巢式RPA内、外侧引物。3)通过质粒或病毒模拟标本梯度稀释,将含不同拷贝数或含量的靶序列RPA扩增,扩增产物以Cas12a检测评价RPA结合Cas12a的检测下限。4)用HIV、HBV、HCV相应近源病毒HTLV、WMHBV、HGBV的同源序列的重组质粒来评价所选crRNA的特异性。结果建立起RPA结合Cas12a核酸检测系统,16份重组质粒的检测下限为10 cp,8份EcoHIV病毒模拟标本的检测下限为1 fg,HIV、HBV、HCV 3种重组质粒及RPA扩增产物的交叉检测间未出现错误检出;10例HIV阳性确证标本的检测结果均为阳性。结论 RPA结合Cas12a检测HIV、HBV、HCV核酸是1种检出限和特异性均较好的核酸检测方法。

摘要：目的改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间。方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA)。2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465细胞系构建Jurkat6465-Luc细胞系,并将20条gRNA置于Jurkat6465-Luc细胞系中筛选出激活能力筛选,选取效率最高的gRNA-L,gRNA-L与dCas9基因激活系统包装成慢病毒感染Jurkat细胞系,建立可对HIV序列高效扩增的工作细胞系Jurkat6465-L。3)用HIV-Luc感染Jurkat细胞系构建HIV潜伏测试细胞系,设定其潜伏频率为1∶500,并与工作细胞Jurkat6465-L置于细胞培养箱中共同培养7和14 d观察工作细胞对HIV潜伏细胞系的激活能力。4)使用HIV激活剂SAHA和dCas9基因激活系统分别作用于设定潜伏频率为1∶500的潜伏细胞,分别比较对潜伏HIV的激活能力。结果首先,测定荧光素酶活性筛选出的2条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O,二者及对照组促进Jurkat6465-Luc的扩增效力(荧光素酶活性强度)(n=3,pg/mL),6 d分别为:85 530±979.2 vs 96 925±2 759 vs 9 876±437(P<0.01);选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞,测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏测试细胞,在培养7、14 d激活HIV潜伏测试细胞的频率测定分别1/864和1/755,比培养14 d用SAHA激活HIV潜伏模型细胞频率1/1 180更接近设定潜伏频率值1/500;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照SAHA激活剂激活HIV潜伏细胞频率1/749相比,更接近于设定频数1/500。结论 dCas9基因激活系统改进HIV体外扩增,可以提高HIV体外扩增检测的效率和灵敏度。

摘要：CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。

摘要：目的:调查妇女产后采取的避孕措施,分析其产后选择避孕方法的影响因素。方法:自行设计调查问卷,选取102例产后1年内的妇女进行调查。结果:88.2%的妇女在产后性生活中采取了避孕措施,产后第1次同房避孕率达52.6%,没有再次生育愿望者对获取避孕知识的需求是有再次生育愿望者的8.918倍(OR=8.918)。学历中亚变量高中学历和妊娠病变对首次同房是否避孕有统计学意义。同时,学历、产次对避孕率影响有统计学意义。结论:多数妇女在产后避孕问题上存在误区,医护工作者及计划生育人员应加大对妇女产后避孕知识的宣教,从而提高产后避孕率。

摘要：目的:为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA(sg RNA)的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法:将针对AAVS1位点的2个sg RNA序列分别插入表达Cas9的质粒p Sp Cas9上,再将其构建为Cas9-sg RNA二合一的共质粒以及独立表达sg RNA和Cas9的双质粒系统;质粒转染293T细胞后,用T7E1酶切方法检测打靶效率。结果:不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切;Cas9-sg RNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。结论:T7E1酶切方法可去除变性退火步骤,简化了传统的检测方法。采用Cas9-sg RNA共表达的载体设计可显著提高打靶效率。

摘要：急性髓系白血病(AML)是一组具有不同生物学特性的血液系统恶性肿瘤,化疗联合异基因造血干细胞移植是AML的基础治疗方案。AML的治疗仍存在巨大的医学需求。在医学需求和生物技术的双重驱动下,治疗AML的药物开发在最近几年取得巨大进展。自2017年4月至2020年底,美国食品药品管理局(FDA)已连续批准9个治疗AML的药物。在我国,除已获批的1个外,其他治疗AML的药物仍处于临床开发阶段。本文将通过回顾上述9种治疗AML药物的关键临床研究数据,结合FDA审评意见和指导规范,对AML治疗药物关键临床研究设计中需要注意的问题逐一讨论。

摘要：逆转录病毒的活动和多种疾病的发生密切相关,其可通过整合自身基因组到宿主基因组中进行大量有害扩增.与此同时,宿主细胞可根据逆转录病毒的整合位置来启动相关通路抑制其活动.因此整合位点的选择是决定逆转录病毒和宿主命运的关键步骤.尽管国际上已有报道称逆转录病毒在宿主基因组上整合并不随机,并发现了跨逆转录病毒种属的不同DNA基序偏好性,但是这些不足以解释一些基序偏好较弱的逆转录病毒如何获得整合特异性.DNA结构特征,如DNA形状被提出可以影响DNA结合蛋白与DNA结合的亲和力,但DNA形状对不同逆转录病毒整合的影响机制尚不清楚.本研究通过构建QRIS(quantify the retrovirus integration specificity)机器学习框架,定量评估了DNA形状对逆转录病毒整合位点的影响.通过系统地研究跨越四个种属的六种逆转录病毒,本研究发现,DNA形状可以独立地或与DNA基序协同调控逆转录病毒的整合.基于此,可将六种逆转录病毒分为三类:“强兼性偏好型”“弱兼性偏好型”和“强形状偏好型”逆转录病毒.此外本研究发现,即使没有特定偏好的DNA基序,“强形状偏好型”逆转录病毒也可以通过DNA形状获得整合特异性.本文基于机器学习对于大规模逆转录病毒插入位点特性的研究,揭示了DNA结构特征在逆转录病毒致病位点选择中的重要作用.该发现在临床方面为治疗逆转录病毒的策略提供了新靶点和新思路,在应用方面有助于更精确地设计慢病毒载体用于基因编辑和基因治疗.此外,本文建立的机器学习框架也为其他种类病毒的整合特异性研究提供了新方法和新视角.