摘要：目的自主研制可以检测白血病染色体MLL基因断裂的双色FISH检测试剂盒。方法根据染色体基因图谱,选定合适的BAC克隆重叠群分别作为MLL基因断裂点5'端探针和3'端探针。采用缺口平移法,制作出5'端标记绿色荧光素,3'端标记红色荧光素的探针。用双盲法检测白血病临床样本40例,对自制探针和同类进口探针在各项技术参数上进行对比研究。结果自制探针检测MLL基因断裂(易位)的阴、阳性率与同类进口产品完全相符;在Spectrum Green和Cy3?v1通道中,自制探针的平均荧光信号强度比进口探针明显提高(自制探针分别为:2930.5±38.00,2766±59.54;进口探针分别为:2239±45.13,1986±59.56;P<0.01),自制探针信噪比分别为进口探针的2.4倍和1.9倍。结论自制的MLL基因FISH检测探针设计合理、质量可靠,与进口探针相比,荧光信号更强,信噪比更高,将来可能替代价格昂贵的进口产品。

摘要：目的评价一种国产血源性人凝血因子Ⅸ（FⅨ）治疗血友病B的有效性和安全性。方法采用多中心、开放、自身对照设计，用目标值法评价FⅨ的有效性。根据入组血友病B受试者的出血状况和FⅨ水平确定输注剂量，首次输注后30 min测定FⅨ回收率，（24±4）h观察出血症状和体征改善，记录不良事件，治疗后90 d检测病原微生物指标及FⅨ抗体。结果36例血友病B患者纳入研究，中位年龄31岁，中位用药次数为4（1~17）次。受试者入组后36次首次出血中，止血效果优良、良好分别为27次（75.00%）、9次（25.00%）。首次输注结束后30 min的FⅨ中位回收率为111.92%（65.55%~194.28）%。未发生研究药物相关不良事件。未发生病毒感染。所有受试者首次用药后90~104 d检测FⅨ抑制物均为阴性。结论试验所用国产血源性FⅨ治疗血友病B具有良好的有效性及安全性。

摘要：目的:基于流式细胞仪光路系统的硬件配置情况,探讨多色流式细胞术实验方案的优化设计。方法:选用6~8周B6小鼠的骨髓细胞作为实验材料,在已有流式抗体的基础上,通过变更BD AriaⅢ流式细胞仪中的滤光片,分别检测各荧光通道信号的相对变异系数%rCV和荧光强度中位值(median of fluorescence intensity,MFI)以及小鼠骨髓中的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)、造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)和多能祖细胞(multipotent progenitor cell,MPP)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果:通过优化光路系统配置,滤光片变更前后各荧光通道的%rCV无明显差异;HSC、HPC、MPP等细胞亚群在PerCP-Cy5.5通道的MFI(ROS水平)均增大;各亚群PerCP-Cy5.5通道的荧光信号(ROS水平)整体右移,实现了多参数流式分析。结论:在多色流式细胞术实验方案设计中,如相关荧光素抗体搭配受限,可通过灵活搭配使用流式细胞仪中的滤光片,合理优化光路系统的硬件配置,达到完成多色流式细胞术检测的目的。

摘要：目的探讨靶向干扰CIAPIN1基因表达对慢性粒细胞白血病(CML)细胞系K562粒系分化的影响。方法针对CIAPIN1基因设计并构建短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,转染K562细胞并作为干扰组,以无关序列shRNA处理的K562细胞作为对照组。采用Real-time PCR及Western blot技术鉴定干扰效率;采用瑞氏染色和电镜分别观测K562细胞形态学和超微结构的改变;采用Real-time PCR方法检测粒系分化标志基因中性粒细胞胞浆因子1(NCF1)、血清黏蛋白1(ORM1)以及粒系分化转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα)、低氧诱导因子1α(HIF1α)mRNA水平的改变;流式细胞术检测K562细胞表面分化抗原CD11b表达的改变;Western blot技术检测ERK1/2、JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平的改变。结果与对照组相比,干扰组的CIAPIN1基因表达被有效抑制(P<0.05);K562细胞的形态和超微结构趋向成熟粒细胞阶段;NCF1、ORM1、C/EBPα及HIF1αmRNA表达水平升高(P<0.05);CD11b表达升高(P<0.01);ERK1/2磷酸化水平升高(P<0.05),而JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平未见明显改变。结论抑制CIAPIN1基因表达能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化,ERK1/2磷酸化水平的升高可能参与了该分化过程。

摘要：目的设计肝癌特异性人甲胎蛋白启动子(hAFPp)操控的跨膜型抗CD3单链抗体(antiCD3scfv),使其仅在AFP阳性(AFP+)肝癌细胞中特异性表达。方法利用分子克隆技术构建pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序验证其基因序列的正确性。取AFP+人肝癌细胞HepG2、Huh-7及AFP阴性(AFP-)正常人肝细胞HL-7702、人乳腺癌细胞MCF-7,利用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定hAFPp的肝癌细胞转录特异性;通过Western blotting、免疫荧光、流式分析检测antiCD3scfv蛋白在细胞的表达、定位及表达效率。结果构建的pAd-hAFPp-CD3scfv腺病毒载体、pAd-hAFPp-antiCD3scfv穿梭质粒载体,经测序后基因序列正确。hAFPp在AFP+的HepG2、Huh-7细胞中转录活性分别为160.86%±26.24%、80.08%±12.64%,而在AFP-细胞中转录活性均90%,而HL-7702、MCF-7均无条带出现。结论携带antiCD3scfv蛋白基因的腺病毒感染周围细胞后,hAFPp调控antiCD3scfv在肝癌细胞的细胞膜特异性表达,进而可能实现antiCD3scfv分子直接介导免疫杀伤的抗肿瘤效果。

摘要：Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一。Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用。缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点。本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA(shRNA)对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响。采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418(400μg/ml)筛选得到抗性克隆。用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力。结果表明:在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果。该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调。MTT法和集落形成实验显示了干扰组、对照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异。结论:抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达。Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用。

摘要：本研究旨在建立免疫球蛋白重链基因重排的实时定量PCR(RQ-PCR)检测方法,并探讨其在急性淋巴系白血病(ALL)微小残留病(MRD)动态监测中的应用价值。采用多重PCR筛选初诊ALL患者的IgH基因单克隆重排,PCR产物测序并进行序列比对,据其连接区序列设计等位基因特异性寡核苷酸(ASO)前向引物,联合下游保守JH引物和保守JH探针,用Taqman探针法RQ-PCR监测ALL患者治疗过程中各时间点的MRD水平,分析其敏感性和特异性。结果表明,在51例ALL患者中鉴定出21例单克隆IgH重排,其中有条件定量的为15例,标准曲线的斜率在-3.1～-3.9,相关系数均>0.98,敏感性在10-4-10-5,仅1例敏感性为10-3,定量范围多在10-4以下,背景的非特异性扩增均在低水平,不影响定量。7例MRD水平在10-3以下的患者一直持续缓解,8例MRD水平>10-3,复发率较高。结论:RQ-PCR方法定量IgH基因单克隆重排用于监测ALL患者的MRD水平,具有敏感性高、特异性强、定量结果可靠的优点。IgH重排水平与ALL患者预后高度相关。

摘要：目的通过RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞VEGF-C表达,探讨干扰后VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的表达。方法根据人VEGF-C mRNA编码序列,设计RNA干扰的靶点,并用脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞,通过RT-PCR法观察转染后肿瘤细胞VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的变化。结果转染siRNA 24h、48h可以使HeLa细胞VEGF-C mRNA含量降低,在24h降低80.63%±0.24%(P<0.001);在48h降低38.9%±0.85%(P<0.01);NF-κB mRNA含量也分别降低,在24h降低37.55±2.76%(P<0.05);在48h降低30.5%±3.82%(P=0.056);bcl-2mRNA含量同时分别降低,在24h降低76.95%±1.91%,(P<0.01);在48h降低64.11%±2.96%,(P<0.05))。结论脂质体介导的VEGF-C siRNA转染HeLa细胞后,可以有效抑制VEGF-C的表达;可能通过下调转录因子NF-κB,抑制抗凋亡基因bcl-2的表达。

摘要：目的对合成的新型4-苯胺基喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂TYIG1~TYIG9进行抗肿瘤活性研究,为寻找具有靶向抗肿瘤活性的候选化合物提供依据。方法采用均相时间分辨荧光（HTRF）法对化合物进行EGFR、VEGFR-2两个靶点的体外活性筛选;采用MTS法对化合物进行肿瘤细胞（A431、A549、H1975、MDA-MB-231）增殖抑制的体外活性评价;采用人肺癌H1975细胞的移植瘤裸鼠模型评价其在动物体内抗肿瘤活性。结果采用HTRF法从合成的一系列化合物中筛选出化合物TYIG4~TYIG9对EGFR、VEGFR-2激酶的活性较好。MTS法检测得到这6个化合物对4种肿瘤细胞（A431、A549、H1975、MDA-MB-231）均有不同程度的抑制作用,其中TYIG6的增殖抑制作用的选择性更为突出;体内试验结果表明TYIG6能够剂量相关性地抑制肿瘤生长,50、100 mg/kg TYIG6对H1975的相对肿瘤抑制率分别为42.59%、34.92%。结论 TYIG6具有良好的体内外抗肿瘤活性,具有成为新型双靶点酪氨酸激酶抑制剂的潜能,有进一步的研究价值。

摘要：近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs。虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点,但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用。本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi-1的载体。以pAdTrackCMV质粒为模板扩增CMV-GFP表达盒,从pGE1BMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd-BMIhRNA-CVM-GFP,转染293A包装细胞,收获病毒。病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用RealTime-PCR和Westernblot检测BMI的表达水平。结果表明:成功构建了pGE1BMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒。感染BmihRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而对照病毒没有明显的效果。结论:腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体。腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体。