摘要：以5月和6月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草(Cordycepssinensis)新鲜子实体为材料,采用分子生物学方法,以rDNA-ITS序列为分子标记,对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)与冬虫夏草之间的关系进行了探讨。以真菌通用引物ITS1/ITS4分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA进行PCR扩增,获得的片段克隆到pMD18-TVector上进行测序,结果表明,随机挑取的46个克隆与某些已在GenBank中注册的中国被毛孢(Hirsutella sinensis)或冬虫夏草的rDNA-ITS序列的一致性均在99%以上,但与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列的一致性约为72%。根据蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列设计了两对特异引物,分别以不同产地及不同生长时期共4个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA为模板,进行PCR及巢式PCR扩增,均得到了相应片段,该片段与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性。在GenBank中注册号为AB067740的另一个标明为冬虫夏草的rDNA-ITS序列与注册号为AJ309353的中国被毛孢的rDNA-ITS序列一致性仅为87.3%,但根据AB067740序列设计特异引物,也从冬虫夏草基因组DNA中扩增到其相应序列。研究结果表明,在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外,还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌。

摘要：羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)编码的羊毛甾醇合酶是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甾醇生物合成途径中重要的限速酶。酿酒酵母固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径的中间体2,3-氧化鲨烯也是三萜类化合物的合成前体。因此,羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点。下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢,可为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物的代谢途径奠定基础。本研究通过设计含有与erg7基因ORF序列两侧同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR,构建带有loxP-Marker-loxP的erg7基因敲除组件,采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法转化双倍体野生型酿酒酵母INVSc1,通过同源重组的方式构建酿酒酵母erg7基因单倍体缺陷型突变株。半定量PCR和实时定量PCR结果表明,突变株内erg7基因表达水平下降约1倍。TLC和HPLC结果表明,突变株内麦角甾醇含量下降至野生型菌株的42%。

摘要：羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径。有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5'长片段(包括erg7基因5'非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5'短片段(包括erg7基因5'非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体p ESC-URA上,构建反义表达质粒。用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株。通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVSc1相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5'长反义片段和5'短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5'短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5'长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低。本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础。

摘要：金丝桃素合酶能催化大黄素生成金丝桃素,根据已发表的金丝桃素合酶的基因序列,设计了6对引物,通过连续重叠PCR快速克隆得到了金丝桃素合酶基因hyp-1。构建含hyp-1基因的原核表达载体pET32ahyp,将该载体导入大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,hyp-1基因在大肠杆菌中获得表达;Western blot结果表明,重组的Hyp-1蛋白具有特异的免疫活性,表明hyp-1基因在***中得到了表达。酶促反应表明,Hyp-1确实能催化大黄素形成金丝桃素,上述结果表明,本研究克隆的hyp-1基因是金丝桃素合酶基因,具备催化大黄素形成金丝桃素的能力,从而为通过合成生物学技术制备金丝桃素奠定了物质基础。

摘要：天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。

摘要：目的设计合成O5′,N6-双取代腺苷衍生物,并评价其降血脂活性,寻找新型降血脂化合物。方法以6-氯嘌呤为起始原料,经4步反应合成目标化合物;通过测试目标化合物对油酸刺激下HepG2细胞内三酰甘油水平的影响及高胆固醇血脂症小鼠总胆固醇含量的影响评价化合物的活性。结果与结论合成了12个未见文献报道的新化合物,其结构经1H-NMR和MS谱确证。活性评价结果显示,多数化合物表现出良好的降血脂活性。

摘要：目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达90%左右，是常规酶切连接法的3倍。与后者相比，该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。

摘要：　　目的构建虎眼万年青 EST 文库，筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA，通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库，获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序，并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列，含有1146条单一基因，cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上，全长率54%，冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似，同源性分别为76%和89%，根据 Blast 比对结果，推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物，以虎眼万年青 cDNA 为模板，通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体，接着导入大肠杆菌进行诱导表达，SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库；并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因，实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达，为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。

摘要：目的设计合成熊果酸28位氨基酸偶联物并测定其保肝活性。方法以熊果酸为起始原料,首先将3位羟基进行酯保护2,8位羧基与保护的氨基酸反应,然后脱保护基,得到偶联物。利用肝细胞培养和小鼠急性肝损伤CCl4、ConA筛选模型分别测定偶联物的体外、体内保肝活性。结果与结论得到3个未见报道的化合物,其结构经核磁共振谱和质谱确定。水溶性测定结果显示3个偶联物的水溶性很低,保肝试验结果显示3个偶联物无明显的保肝活性。

摘要：目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。