摘要：目的:利用骨肉瘤OS-732细胞,探讨survivin反义寡核苷酸(ASODN)对survivin基因表达的影响及其诱导肿瘤细胞凋亡的效应。方法:设计合成特异性靶向survivin的ASODN,以不同浓度和时间对OS-732细胞进行转染,并设空白、正义(SODN)对照组进行比较。采用RT-PCR、Westernblotting、免疫细胞化学技术检测各组OS-732细胞中survivinmRNA、蛋白表达状态,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡水平和形态变化,MTT法检测细胞生长抑制情况,激酶活性测定法检测细胞中caspase-3活性程度。结果:转染ASODN各组OS-732细胞survivinmRNA和蛋白表达均明显弱于空白对照组、SODN组;细胞凋亡率(AI)显著增加,细胞生长相应受抑,caspase-3活性显著提高;上述效应在ASODN各组存在一定的时间浓度依赖性;而SODN各组与空白对照组间各项指标均无明显差异。结论:ASODN能够特异性下调OS-732细胞中survivin基因表达,激活凋亡效应蛋白酶caspase-3,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。

摘要：目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN，按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞，设正义（SODN）和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态，Western blot检测VEGF蛋白表达，MTT法测定细胞生长抑制率（IR），流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较，ASODN组细胞中VEGF表达显著降低（P〈0．05），IR（分别为10μmol／L组34．21％，20μmol／L组39．50％）显著增高（P〈0．05），上述效应呈浓度依赖性；镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退，当转染浓度至20μmol／L时，其凋亡率AI值（18．25±0．40）％显著高于对照组（5．20±0．28）％和SODN组[（6．41±0．10）％，P〈0．01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达；并可抑制细胞增殖，诱导其凋亡。

摘要：目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化*** DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

摘要：目的研究不同血流状态下培养内皮细胞紧密连接的变化。方法设计一种新的平行平板流室模型,高速摄像微粒子示踪技术流体分析,培养内皮细胞进行7H6免疫荧光染色,F-肌动蛋白荧光染色和ZO-1双重免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果液体在入口与狭窄开始处中点的流速为249.8mm/sec,剪切应力为71.9dyn/cm2;进入狭窄段时的流速为316mm/sec,剪切应力为88.5dyn/cm2,上述区域液体为定常流。F-肌动蛋白纤维表达明显增加,呈束状,与液流方向一致,细胞变为细长。ZO-1和7H6则位于细胞周围呈现连续、线状环形分布。液体进入宽广区域后液体流速明显减慢并在两侧形成涡流甚至停滞,流速为54.4～119.6mm/sec,剪切应力为15.6～34.4dyn/cm2,F-肌动蛋白纤维分布和排列无方向性,细胞轮廓成不规则多边形,ZO-1和7H6在细胞周围呈点状分布。结论低剪切应力更易导致动脉硬化。