摘要：PBL课程模式是高等医学院校创新教育的重要组成部分。在PBL实施过程中,病例的选择与设计关系到PBL教学的成败。为激发学生独立思考、创新思维及分析问题和解决问题的能力,分别探讨了原始病例和模拟病例的作用及相互关系,提出了病原生物学PBL模拟病例设计过程中应遵循的基本原则,即客观性原则、灵活性原则、一致性原则、启发性原则和关联性原则。

摘要：目的构建肺孢子虫(菌)p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因(CAG)片段连接到质粒pGEX-6p-1(含GST标签)上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。

摘要：目的构建靶向Rab 9 GTPase siRNA表达载体。方法设计有小发夹RNA结构靶向Rab9GT-Pase的68个碱基的寡核苷酸,克隆入表达载体***+EGFP,得到重组质粒***+EGFP-R1和***+EGFP-R2,通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体***+EGFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siR-NA序列相同。结论成功构建了靶向Rab9 GTPase siRNA表达载体,为进一步研究Rab9 GTPase与麻疹病毒复制之间的关系奠定基础。

摘要：目的建立一种快速、准确的鉴定无菌性脑膜炎患者肠道病毒感染的方法。并与传统的细胞培养及血清分型相比较。方法对78例无菌性脑膜炎患儿脑脊液中肠道病毒,用人宫颈癌细胞(HeLa)、横纹肌细胞(RD)和人喉癌细胞(Hep-2)细胞进行分离培养血清分型,同时用根据肠道病毒5’UTR区基因序列设计引物,用PCRT-R法扩增病毒的基因。结果该方法可检测的灵敏度的组织培养感染量(TCID50)为0.1;78例脑脊液(CSF)中46例肠道病毒培养为阳性,而用RT-PCR法检测52例阳性。结论该方法与细胞培养及肠道病毒血清分型法相比较具有较高的灵敏度和特异性,可快速、灵敏地检测脑脊液中的肠道病毒。

摘要：目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银(GMS)染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体(光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体)为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%(14/20),对照组检出率为0(0/20)。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%(20/20),对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义(P<0.05)。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。

摘要：目的检测呼吸疾病患者肺内肺孢子菌基因阳性率,探讨肺孢子菌定植或感染的影响因素及其与呼吸系统疾病的相关性。方法设计3对特异性引物,构建检测肺孢子菌16SrRNA基因的LAMP反应体系。通过对大鼠感染模型的肺孢子菌基因检测,验证其敏感性和特异性;通过对临床呼吸疾病患者痰液样本肺孢子菌基因的检测,分析肺孢子菌感染或定殖与呼吸系统疾病的相关性及其影响因素。结果本研究建立的LAMP方法检测肺孢子菌16SrRNA基因的最低检测极限为50copies/mL;与念珠菌等8种呼吸道病原体不发生交叉反应。共收集和检测98例呼吸疾病患者痰标本,肺孢子菌基因总检出率为63.3%(62/98)。合并呼吸道感染者63例,非合并感染者35例,肺孢子菌基因阳性率分别为60.3%和75.0%,χ2检验两者差异有统计学意义。肺部影像学有改变者肺孢子菌基因检出率为72.5%,肺部影像学无改变者检出率为53.19%,χ2检验两者具有显著性差异。COPD和非COPD患者肺孢子菌基因检出率分别为53.2%和71.2%,χ2检验两者无显著性差异;COPD急性发作期和稳定期阳性率分别为66.8%和46.9%,χ2检验两者差异无统计学意义。CD4+T淋巴细胞数降低患者肺孢子菌基因检出率80.0%;CD4+T淋巴细胞数正常者的检出率为60.27%,χ2检验两者差异具有统计学意义。1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和含量正常患者的肺孢子菌基因检测结果显示,χ2检验两者差异无统计学意义。结论呼吸疾病患者中肺孢子菌基因检出率较高。两者是否有直接的因果关系尚需进一步研究。合并其他细菌感染者肺孢子菌基因阳性率较低,其机制有待于进一步研究。CD4+T细胞数降低者肺孢子菌基因阳性率升高,符合肺孢子菌为机会感染的特点。

摘要：为了鉴定抑制麻疹病毒体外复制的靶向Rab9 GTPase基因效应性小干扰RNA(siRNA),根据siRNA设计原则和Rab9 GTPase基因的mRNA序列,设计并化学合成8对靶向Rab9 GTPase基因的siRNAs和1对阴性对照siRNA,经脂质体法转染Vero-E6细胞株,转染10 h后感染麻疹病毒Edmonston株。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后细胞内Rab9 GTPase mRNA水平;通过标准蚀斑试验检测麻疹病毒滴度。同对照组相比,8对靶向Rab9 GTPase基因siRNAs中的2对(Rab9-4和Rab9-7),以时间和剂量依赖性的方式显著地抑制细胞内Rab9 GTPase mRNA表达和麻疹病毒的复制(抑制率高达90%以上),其他的siRNAs对细胞内Rab9 GTPase mRNA表达和麻疹病毒的复制的抑制性效应则低于50%。结果表明,Rab9-4和Rab9-7是体外抑制麻疹病毒复制的最有效的siRNAs,这些siRNAs靶序列能被用来深入研究RNA干扰治疗麻疹病毒感染的可能性。

摘要：目的分析本院分离到的人源性棘球蚴的基因型,为辽宁省棘球蚴病的分子流行病学提供资料。方法经外科手术方法从患者肝内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,对PCR产物进行测序,测序结果应用Blast进行分析,并与GenBank数据库中序列进行比对。结果 cox1扩增产物及测序的结果提示,本例样本与细粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差异性为0.1%,基因型属于G1亚型。并与其他国家的25个分离株序列一致。结论线粒体基因组的cox1基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。辽宁地区首次报道了细粒棘球绦虫的基因型为G1亚型,其序列与国内外的多个分离株保持一致,为棘球蚴病的分子流行病学补充了资料。

摘要：目的构建靶向Rab9 GTPase基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,观察shRNA对Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株体外复制的抑制效应。方法按照shRNA的设计要求和Rab9 GTPase基因序列构建靶向Rab9 GTPase基因shRNA表达载体,表达载体经酶切鉴定和序列分析后通过脂质体法转染Vero-E6细胞,然后感染麻疹病毒Edmonston株,通过RT-PCR和Western blot检测转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平;通过标准蚀斑试验检测病毒滴度,观察shRNA对麻疹病毒Edmonston株复制的抑制效应。结果靶向Rab9 GTPase基因的shRNA可特异性抑制Vero-E6细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达,最大抑制率分别为(86.3±0.7)%和(87.6±0.7)%;蚀斑试验检测Rab9 GTPase基因表达沉默后对麻疹病毒Edmonston株体外复制抑制率达90%以上,且抑制效应至少可持续32 d。结论靶向Rab9 GTPase基因的shRNA能特异性抑制Rab9 GTPase表达和麻疹病毒Edmonston株体外复制,有望成为抗麻疹病毒感染治疗的核酸药物。

摘要：构建Rab9 GTPase siRNA表达载体,观察siRNA对哺乳动物细胞内Rab9 GTPase表达的抑制作用,为应用Rab9 GTPase siRNA表达载体进行抗麻疹病毒感染研究奠定基础。根据Rab9 GTPase基因的mRNA序列设计合成2对靶向Rab9 GTPase基因的寡核苷酸,克隆到表达载体***+EGFP,通过双酶切和序列分析对重组表达载体进行鉴定。将鉴定为阳性的重组表达载体转染B95a细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达水平。双酶切和序列分析表明成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,RT-PCR和Western-blot技术实验表明重组表达载体可显著抑制B95a细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白的表达(最高抑制率分别为89.4%±0.5%和87.6%±0.7%),而对照组则没有变化。结果表明,成功构建了Rab9 GTPase siRNA表达载体,该表达载体可有效地抑制Rab9 GTPase在哺乳动物细胞内的表达。