摘要：如何进行中药方剂中各种成分在某一疗效中作用的比较和筛选;以及如何获得最佳中药组方等问题都是急待解决的关键问题之一.有鉴于此,本文用数学领域中常用的排列组合及数理统计等方法对这一问题进行了初步探讨.……

摘要：目的:利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建质粒重组体,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。方法:原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,15%DMEM培养液调细胞浓度为2×107cells/L接种于6孔板,3 mL/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24 h后ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度、RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段克隆入质粒载体,转化DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析。结果:LPS刺激巨噬细胞24 h后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度较对照组下降最明显(P<0.05),达59.46%,TNF-α mRNA的表达较对照组被抑制了61.20%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列。结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-αmRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。

摘要：目的分析PDCD5蛋白的不同功能区域,将这些区域所对应的序列与质粒pEGFP-C1相连接,在胃癌细胞中表达后,检测其细胞定位。方法设计带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的PDCD5引物共4对,包括完整的PDCD5蛋白序列及3个不同功能区域的序列。以上质粒构建完成后,转染胃癌细胞SGC-7901。荧光显微镜检测融合蛋白的表达定位。结果经酶切鉴定,可见相应长度的4种序列,后经测序确定序列无误,荧光显微镜检测融合蛋白表达。结论代表PDCD5蛋白不同功能区域的质粒成功构建,并在SGC-7901细胞中表达。经过观察绿色荧光蛋白,确定4种蛋白均定位于细胞浆内。

摘要：目的设计一种全新概念的细胞芯片。方法将CD3,CD4,CD8抗体固定于醛基玻片上,形成3×3阵列,从全血中分离出的单个核细胞与之反应,形成选择性细胞群。将细胞芯片进行扫描电镜观察,台盼蓝染色,瑞氏染色,CD3Cy5+CD4-FITC+CD8RPE三色荧光染色并观察结果。结果电镜照片显示所结合淋巴细胞外形完整,细胞膜表面有呈皱折状突起,还可见散射状的细长毛状突起。台盼蓝染色显示活细胞数>95%;瑞氏染色细胞形态良好,杂交点边缘整齐,背景干净;荧光染色显示特异性良好。结论本实验能根据细胞表面不同的免疫标志进行细胞分群,可为以后制作大规模、高通量的细胞芯片做准备,并提出了全新意义的细胞芯片模型。

摘要：目的:探讨3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP-DH)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)促人甲状腺癌细胞凋亡中的作用机制。方法:利用微小干扰RNA(siRNA)技术,设计沉默GAPDH基因表达序列,分别按经N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)预处理前、后(si-GAPDH、siGAPDH+L-NAME)组及siRNA对照进行分组,并设空白对照组同步进行甲状腺未分化癌细胞系(FRO)转染实验。蛋白质印迹法检测细胞中GAPDH蛋白表达,台盼蓝法检测细胞生存率,DNA裂解分析检测细胞凋亡,Caspases-3酶分析测定活性,一氧化氮(NO)产物测定法检测各组细胞亚硝酸盐和硝酸盐水平。结果:siGAPDH下调FRO细胞中GAPDH蛋白表达,细胞核中GAPDH几乎完全被封闭;与siRNA对照组细胞生存率(37%)相比,siGAP-DH组(60%)和siGAPDH+L-NAME组细胞生存率(67%)显著增加(χ2=4.88,P=0.027;χ2=7.98,P=0.026);Caspase-3活性显著下降(t=9.59,P=0.001;t=11.86,P=0.000),但两组间差异无统计学意义,t=1.65,P=0.172;siGAP-DH组和siRNA对照组NO产物较siGAPDH+L-NAME组显著增加(t=36.95,P=0.000;t=52.1,P=0.000),但两组间差异无统计学意义,t=2.563,P=0.062。结论:GAPDH作为NO产物作用的下游因子参与TRAIL促人甲状腺癌细胞凋亡作用。

摘要：目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化*** DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

摘要：背景:脊髓的局部低温保护减轻了创伤性脊髓损伤后的二次损伤,但是低温深度与保护程度是否具有相关性目前尚不清楚。目的:研究局部低温的程度与大鼠脊髓缺血损伤保护的相关性。设计:完全随机对照实验。地点和对象:实验在中国医科大学普外三科实验室完成,采用雄性Wis-tar大鼠。干预:模拟制作大鼠脊髓缺血动物模型,对L5～L10行逆行蛛网膜下腔低温生理盐水灌注,控制脊髓核心温度在38℃,34℃,30℃,18℃4个水平,近端动脉压控制在5.3～6.6kPa,阻断时间分别为12,16min。主要观察指标:观察动物截瘫数及截瘫指数并作组织学检查。结果:实验动物的截瘫数及截瘫指数随着温度的降低而降低。38℃,34℃,30℃,18℃各组阻断12min后,截瘫数分别为6,3,0,0;阻断16min后分别为8,6,5,0。截瘫指数0-4评定结果为,阻断12min,38℃分别为2,1,2,3,0;34℃分别为4,1,2,1,0;30℃和18℃8只截瘫指数均为0;阻断16min,38℃分别为0,0,1,4,3只;34℃分别为2,1,3,2,0只;30℃分别为4,2,2,0,0只;18℃8只截瘫指数均为0。组织学检查显示随着温度降低,脊髓缺血损伤逐渐减轻。结论:与轻、中度低温相比,深度低温对脊髓缺血损伤的保护作用更显著,局部低温的深度与大鼠脊髓缺血损伤保护程度呈正相关。

摘要：目的研究不同血流状态下培养内皮细胞紧密连接的变化。方法设计一种新的平行平板流室模型,高速摄像微粒子示踪技术流体分析,培养内皮细胞进行7H6免疫荧光染色,F-肌动蛋白荧光染色和ZO-1双重免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果液体在入口与狭窄开始处中点的流速为249.8mm/sec,剪切应力为71.9dyn/cm2;进入狭窄段时的流速为316mm/sec,剪切应力为88.5dyn/cm2,上述区域液体为定常流。F-肌动蛋白纤维表达明显增加,呈束状,与液流方向一致,细胞变为细长。ZO-1和7H6则位于细胞周围呈现连续、线状环形分布。液体进入宽广区域后液体流速明显减慢并在两侧形成涡流甚至停滞,流速为54.4～119.6mm/sec,剪切应力为15.6～34.4dyn/cm2,F-肌动蛋白纤维分布和排列无方向性,细胞轮廓成不规则多边形,ZO-1和7H6在细胞周围呈点状分布。结论低剪切应力更易导致动脉硬化。

摘要：病理生理学实验教学是巩固基础理论、强化学生基本操作技能的重要课程。目前病理生理学实验教学内容及教学模式单一,缺乏有效的课堂教学考核机制,教师容易忽视对学生综合能力的培养,而且学生缺乏主观能动性及团队协作。文章从遵循动物伦理及加强课程思政,丰富教学内容及教学模式,设立综合性教学考核机制等方面设计并施行改革计划。

摘要：为建立人肝脏及肾脏组织中β-葡萄糖醛酸酶(β-G)mRNA的检测方法,并进行比较,收集10例正常肝脏、10例正常肾脏及8例肝癌组织,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,研究β-GmRNA在组织中的表达。结果表明,β-GmRNA的基因扩增产物在人肝脏及肾脏组织中均有表达,且产物大小一致,均为422bp;正常肝脏组织β-GmRNA相对表达含量(1·71±0·32)与正常肾脏组织(1·83±0·22)比较,差异无统计学意义(P>0·05);而肝癌组织(3·88±0·86)显著高于正常肝脏组织,差异有统计学意义(P<0·01)。结论:通过查找基因文库β-G基因序列并设计引物,检测肝脏及肾脏组织中β-GmRNA基因表达的方法是可行的,进一步对肝癌组织中β-GmRNA变化的探讨,对肝癌的分子机制研究可能有重要意义。