摘要：目的:构建编码ubiquitin specific peptidase 22(USP22)截短蛋白的表达质粒,探索USP22在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用及其分子机制,并初步解析USP22在HCC细胞系中对细胞增殖及索拉菲尼作用的影响。方法:设计合成针对于人源USP22截短质粒序列的引物,通过PCR的方法以含有USP22全长蛋白编码序列的表达载体作为模板,扩增目的片段,再用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,连接转化后,将构建好的质粒进行酶切鉴定及测序,证明USP22截短质粒构建成功。将构建好的USP22全长及截短表达质粒转染到HCC细胞系HCC-LM3中,分别进行Western blot和confocal实验检测USP22全长及截短质粒在HCC-LM3细胞中的表达及定位。生物学功能方面,利用MTS法检测USP22全长对HCC细胞增殖及索拉菲尼作用的影响。结果:成功构建了USP22截短表达质粒,并在HCC细胞系HCC-LM3中验证了其蛋白表达;USP22全长及所构建的截短质粒编码蛋白在HCC-LM3中定位于细胞核;此外,生物学功能实验证实USP22促进HCC-LM3细胞增殖,并削弱了索拉菲尼对HCC-LM3细胞生长的抑制作用。结论:在HCC-LM3细胞中,USP22及其截短质粒编码蛋白均定位于细胞核;USP22促进HCC细胞增殖,且可能参与在HCC治疗中的索拉菲尼耐受进程。

摘要：肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞、细胞外基质及多种因子构成的局部微环境,在肿瘤生存、生长、侵袭、转移等过程中发挥重要作用,目前已成为肿瘤治疗的新靶点。微流控芯片具有微型化、设计灵活、易于集成、便于实时观察及高通量、低成本等优势,因而更易于建立接近体内真实肿瘤微环境的体外模型,包括模拟肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移,建立药物筛选及分析模型和肿瘤芯片,为深入研究肿瘤微环境的相关分子机制及开发新药提供有效途径。

摘要：目的:构建赖氨酸去甲基化酶2A(lysine demethylase 2A,KDM2A)全长及截短重组表达质粒,并初步探究其在前列腺癌CWR22Rv1细胞中的定位及机制。方法:根据KDM2A的mRNA编码序列及蛋白结构域特点设计合成KDM2A全长及截短表达序列的引物,以含有KDM2A全长编码序列的质粒作为模板,通过PCR扩增目的片段,再用限制性内切酶NotⅠ和XbaⅠ进行双酶切,连接转化后,挑取单克隆菌落扩增,并提取质粒进行酶切鉴定及测序比对。将序列比对正确的KDM2A全长及截短重组质粒转染到HEK293细胞中,进行Western Blot实验检测KDM2A全长及截短蛋白在HEK293细胞中的表达。将构建好的KDM2A全长及截短重组质粒转染到前列腺癌CWR22Rv1细胞中,进行免疫荧光染色检测外源的KDM2A全长及截短蛋白在细胞中的定位。结果:构建了KDM2A全长及截短重组表达质粒;重组质粒能够在细胞中表达;KDM2A全长蛋白主要分布在细胞核,少量分布在细胞质;C1截短蛋白分布在细胞核;N1、C2截短蛋白分布在细胞质。结论:KDM2A蛋白的核定位序列位于564-888位氨基酸之间,本实验为后续深入研究KDM2A在肿瘤中的作用及分子机制提供了实验基础。

摘要：目的构建USP14全长及截短表达质粒并且初步探讨USP14在子宫内膜癌中的作用。方法设计USP14全长及截短的特异性引物,通过PCR合成相应cDNA片段,并用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切,连接转化后将构建好的质粒进行测序,成功构建后将其转染至COS7中,观察全长及截短在COS7中分布。通过划痕实验以及MTS实验探究其对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响。结果成功构建USP14全长及截短表达质粒,在COS7细胞中,全长及C端截短定位于细胞浆中,N端截短主要定位于细胞核;USP14能够促进子宫内膜癌细胞的迁移并提高子宫内膜癌细胞的生存活力。结论在COS7细胞中,USP14全长及C端截短分布于细胞浆,N截短大部分分布于细胞核,USP14能够促进子宫内膜癌细胞的生长和迁移。